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ICS 11.220 B 41 DB14 山西省地方标准 DB 14/T 17892019 禽流感病 毒H7 亚型 抗体竞争ELISA 检测方法 2019-06-25 发布 2019-08-25 实施 山西省市场监督管理局 发布 DB14/T 17892019 I 目 次 前言.II 1 范围.1 2 缩略语.1 3 实验原 理.1 4 实验条 件.1 5 实验方 法.1 6 结果判 定.2 7 注意事 项.3 附录A（规 范性 附录）试剂配 制方 法.4 DB14/T 17892019 II 前 言 本标准 按照 GB/T 1.1-2009 给出 的规 则起 草。本标准 由山 西省 农业 农村 厅提出 并监 督实 施。本标准 由山 西省 农业 标准 化技术 委员 会归 口。本标准 起草 单位：山 西省 动物疫 病预 防控 制中 心、武汉科 前生 物股 份有 限公 司、华 中农 业大 学。本标准 主要 起草 人：雷宇平、王仲 兵、郎小 兵、金梅林、董晓 辉、但汉 并、卢月、胡明明、王治维、芦俊彦、樊 慧锦、宁 艳、雷冲、王锦、刘 田勇。DB14/T 17892019 1 禽 流感病 毒 H7 亚型 抗体竞 争 ELISA 检 测方法 1 范围 本标准规定 了应用 竞争酶联 免疫吸附 法检测 血清中禽 流感病毒H7 亚型 抗体方法 的缩略语、实验 原理、实 验条 件、实验 方法、结果 判定 和注 意事 项。本标准 适用 于禽 流感 病毒H7 亚型 抗体 的检 测。2 缩略语 下列缩 略语 适用 于本 文件。ELISA：酶 联免 疫吸 附试 验（enzyme linked immunosorbent assay）OD：光 密度 值(optical density)HRP：辣根 过氧 化物 酶(horseradish peroxidase)3 实验原 理 本标准 采用 竞争 酶联 免疫 吸附法，该 方法 利用 抗原 抗体反 应具 有特 异性 的特 点，将 特异 性的H7亚型禽流感病 毒血凝 抑制试 验抗 原吸附 到固相 载体的 表面，将待 检血清 和特异 性酶 标单抗 同时加 入包被 板孔。由待 检血 清中 的抗 体和酶标 单抗 竞争 与包 被抗 原结合，待检 血清 中抗 体越多，结合在 包被 抗原 上的酶标单 抗就 越少，阳 性血 清反应 呈色 浅于 阴性 血清。4 实验条 件 4.1 实验室 环境 实验操 作在15 25 下进行。未 灭活 的感 染性 材料的 实验 活动，应 在 级生物 安全柜内 进行。4.2 仪器 级生 物安 全柜、离 心机、酶标 仪、洗板 机（或手 洗）、微量 移液 器、冰箱、恒温 箱。5 实验方 法 5.1 实验材 料 禽流感 病毒H7 亚型 包被抗 原、HRP 标记 的禽流 感病 毒H7亚型HA 蛋白 的单 克隆抗 体（酶 标记物）、底物液、终止 液、样品 稀释 液、洗 涤液、包 被液、封 闭液。试剂配 制方 法见 附录A。5.2 样品准 备 DB14/T 17892019 2 取动物 全血，待血液 充分 凝固后，4 000 r/min离心10 min，收集 血清。也可 等凝固 后自然 析出 血清。血 清应 清亮，无 溶血。样品处 理过 程中 应防 止样 品的污 染，注意 个人 安全 防护。5.3 包被 用包被 液将 包被 抗原 稀释 至工作 浓度2 g/mL，加 至抗原 包被 板中，每孔100 L，放 置2 8 条件下，包 被15 h。5.4 封闭 弃去包 被液，每孔 加入 封 闭液200 L，置37 1 孵 育2 h；弃去 封闭 液，拍干，再置37 1 干 燥2 h。5.5 待检血 清的 稀释 待检血 清在 血清 稀释 板中 做10倍稀释。5.6 操作步 骤 5.6.1 加样 取抗原 包被板，先 用洗涤 液洗涤 抗原包 被板1 次，稀 释好的 待检血 清、阴性对 照和阳 性对照 各取50L，加 至抗 原包被 板中，每板待 检血清 设1孔，阴、阳性对 照各设2孔，同时 加 入酶标 记物50 L。轻轻振匀 孔中 样品，置37 1 下温 育45 min。5.6.2 洗涤 弃去孔 中液 体，每孔 加入 洗涤液200 L，重复 洗涤5 次，最 后一 次拍 干。5.6.3 加酶标 抗体 将辣根 过氧化 物酶（HRP）标记的 抗体用 封闭液1:1000稀释，每孔加100 L，37 1 放 置30 min。5.6.4 洗涤 弃去孔 中液 体，每孔 加入 洗涤液200 L，重复 洗涤5 次，最 后一 次拍 干。5.6.5 加底物 液 每个反 应孔 加入 底物 液100L，置20 25 下 避 光显色15 min。5.6.6 加终止 液 每孔加 终止 液50 L，10 min 内在 酶标 仪上 测定450 nm 波长 处的OD 值。6 结果判 定 试验成 立的 条件：阴 性对 照的平 均OD450nm 值大于1.0，阳性 对照 的抑 制率（PI 值）大 于50%。S=样品 孔OD450nm 值，N=阴性 对照孔 平均OD450nm 值。PI值=(1-S/N)100%。DB14/T 17892019 3 若被检 样品的 抑制 率小于40%，该 样品判 为禽 流感病 毒H7亚 型抗体 阴性。若被 检样品 的抑制 率大 于或等于40%，该 样品 判为 禽流感病 毒H7 亚型 抗体 阳性。7 注意事 项 7.1 人员防 护 实验过 程中 注意 做好 个人 的安全 防护 工作。7.2 样品处 理 血清应 在 级生 物安 全柜 中析出。7.3 废弃物 处理 操作区 应有 专门 的固 体和 液体废 弃物 收集 容器。废 弃物经 高压 灭菌 后按 相关 规定处 理。DB14/T 17892019 4 A A 附 录 A（规范 性附 录）试剂配 制方 法 A.1 包被液 包被液 为碳酸 盐缓冲 液（0.025 mol/L，pH 9.6）。将下列 试剂按 序加入1 000 mL规格 的容器 中，加800 mL蒸馏水 充分 溶解，定容 至1 000 mL。碳酸钠（Na2CO3）1.59 g 碳酸氢 钠（NaHCO3）2.93 g 加蒸馏 水至 1 000 mL A.2 洗涤液 氯化钠（NaCl）8.0 g 氯化钾（KCl）0.2 g 十二水 磷酸 氢二 钠（Na2HPO4 12H2O）2.9 g 磷酸二 氢钾（KH2PO4）0.2 g Tween-20 0.5 mL 加蒸馏 水至 1 000 mL A.3 底物液 商品化TMB 显色 液。A.4 终止液 98%浓硫酸（H2SO4）108.8 mL 加蒸馏 水至 1 000 mL A.5 样品稀 释液 氯化钠（NaCl）8.0 g 氯化钾（KCl）0.2 g 十二水 磷酸 氢二 钠（Na2HPO4 12H2O）2.9 g 磷酸二 氢钾（KH2PO4）0.2 g 加蒸馏 水至 1 000 mL A.6 封闭液 牛血清 白蛋 白（BSA）5.0 g DB14/T 17892019 5 氯化钠（NaCl）8.0 g 氯化钾（KCl）0.2 g 十二水 磷酸 氢二 钠（Na2HPO4 12H2O）2.9 g 磷酸二 氢钾（KH2PO4）0.2 g 硫柳汞 钠 0.2 g 加蒸馏 水至 1 000 mL _
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