禽腺病毒4型PCR检测方法DB13／T 2593-2017.pdf

ICS 11.220 B 43 DB13 河北省地方标准 DB13/T 2593 2017 禽腺病毒4 型PCR 检测方法 2017-11-22 发布 2017-12-22 实施 河 北 省 质 量 技 术 监 督 局 发布 DB13/T 2593 2017 I 前 言 GB/T 1.1-2009 DB13/T 2593 2017 1 禽腺病毒4 型 PCR 检测方法 1 范围 4 PCR 4 2 术语和 定义 2.1 DNA deoxyribonucleic acid 2.2 EB ethidium bromide 2.3 PCR polymerase chain reaction 2.4 dNTP deoxy-ribonucleoside triphosphate 3 试剂或 材料 1.0%50 TAE EB 10 ug/L DEPC DNA 100 bp 2Taq MasterMix PCR 警示:EB EB DEPC 3.1 3.2 1.0%A A.1 3.3 50 TAE A A.2 3.4 EB 10 ug/L A A.3 3.5 DEPC A A.4 DB13/T 2593 2017 2 3.6 DNA 100 bp:100 bp 250 bp 500 bp 750 bp 1000 bp 2000bp 3.7 3.8 PCR PCR dNTP RNA 3.9 B B.1 10 mol/L 4 仪器设 备 4.1 PCR 4.0 99.9 0.2 mL 4.2 DNA 0.1 ng 1360 1024 10bit USB 2.0 4.3 16000 r/min 1.5 mL 12 4.4 50 V 120 V 10 mA 800 mA 0min 999min 4.5:4.6:4.7:0.5 10 L 2 20 L 10 100 L 100 1000 L 4.8:100 5 样品 5.1 阴阳性 对照 4-20 5.2 样品的 采集 与处 理 5.2.1 采集工 具 121 2 20 min a)b)c)d)1.5 mL e)5.2.2 棉拭子 采集 1.0 mL PBS A A.5 1.5 mL 5.2.3 组织采 集 DB13/T 2593 2017 3 5.2.4 样品储 运 24 h 5.2.5 样品的 处理 5.2.5.1 棉拭子 处理 方法 4 3000 r/min 15 min 1.5 mL 5.2.5.2 组织的 处理 方法 1:5 4 3000 r/min 15 min 1.5 mL 6 操作步 骤 6.1 DNA 的 提取 DNA 6.1.1 20 L K 1.5 mL 200 L 200 L BB5 15 s 56 15 min 6.1.2 250 L 15 s 5 min 6.1.3 12000 r/min 1 min 6.1.4 500 L WB5,12000 r/min 1 min 6.1.5 12000 r/min 1min 1 min 3 min 6.1.6 1.5 mL 20 L RNase-free Water 1min 6.1.7 12000 r/min 1min DNA-20 6.2 PCR 8 L 10 L 2Taq MasterMix 1 L DNA 0.5 L 10 mol/L 0.5 L 10 mol/L 20 L PCR 94 3 min 94 10 s 56 30 s 72 57 s 30 72 5 min 4 7 试验数 据处 理 DB13/T 2593 2017 4 7.1 扩增产 物的 电泳 检测 1.0%1 TAE 3 L 5 L DNA 100 bp 110V 30 min 40 min 7.2 结果判 定 PCR 954 bp 4 PCR 954 bp 4 PCR C C.1 8 试验报 告 DB13/T 2593 2017 5 附 录A（规范 性附 录）相关试 剂的 配制 A.1 1.0%琼脂 糖凝 胶 1.0 g 100 mL 1 TAE 60 5 L 3 mm 5 mm A.2 50 TAE 电泳 缓冲 液 A.2.1 0.5 mol/L EDTA 溶液（pH 8.0）EDTA 18.61 g 100 mL pH 8.0 A.2.2 TAE 电 泳缓 冲液（50）Tris 242 g 57.1 mL 0.5 mol/L EDTA 100 mL 1000 mL A.3 溴化 乙锭（EB）溶 液 20 mg 20 mL A.4 DEPC 水 DEPC 50 L 100 mL 6 h 8 h 121 2 20 min 1.5 mL DEPC A.5 PBS 缓冲 液 A.5.1 A 0.2 mol/L NaH2PO4 H2O 27.6 g 1000 mL A.5.2 B 0.2 mol/L Na2HPO4 7H2O 53.6 g Na2HPO4 127H2O 71.6 g Na2HPO4 2H2O 35.6 g 1000 mL A.5.3 0.01 mol/L pH 7.2 A 14 mL B 36 mL NaCl 8.5 g 1000 mL DB13/T 2593 2017 6 附 录 B（规范 性附 录）引 物 B.1 表B.1 上 游引 物和 下游 引 物的浓 度和 序列 5-3 10 mol/L CCG ACC GTT ACA AGT TTA GCA T 10 mol/L TTC GCA GGA AGT CGT AGT GGA DB13/T 2593 2017 7 附 录C（规范 性附 录）禽腺病 毒4 型 PCR 产 物电 泳图 说明：M DNA 100 bp 1 2 图 C.1 禽 腺病 毒4 型PCR 产物电 泳图 _