水貂病毒性肠炎检疫技术规范DB22／T 2560-2016.pdf

ICS 11.220 B 41 DB22 吉林省地方标准 DB 22/T 25602016 水貂病毒性肠炎检疫技术规范 Quarantine protocol for mink viral enteritis 2016-12-09发布 2017-03-01实施吉林省质量技术监督局 发布 DB22/T 25602016 I 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009和GB/T 20001.4-2015给出的规则起草。本标准由吉林出入境检验检疫局提出并归口于吉林省畜牧业管理局。本标准起草单位：吉林出入境检验检疫局检验检疫技术中心，中国农业科学院特产研究所。本标准主要起草人：王伟利、王建科、孟庆峰、程悦宁、易立、姚贵哲、王准、宋翱、程世鹏。DB22/T 25602016 1 水貂病毒性肠炎检疫技术规范 1 范围 本标准规定了水貂病毒性肠炎的病原分离鉴定、HA-HI试验、PCR、Real-time PCR及动物回归试验等诊断技术要求。本标准适用于水貂病毒性肠炎的检疫、疫情监测和流行病学调查。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析试验室用水规格和试验方法 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件 MEV：水貂肠炎病毒 F81：猫肾传代细胞 CPE：细胞病变 Real-time PCR：实时荧光定量PCR PBS：磷酸盐缓冲液 HA：血凝试验 HI：血凝抑制试验 4 材料与试剂 4.1 材料 注射器（5 mL、20 mL）吸管（5 mL、10 mL）离心管（1.5 mL、0.2 mL）吸头 96 孔微量血凝板 细胞培养瓶 PCR 管 试验动物：3月龄健康水貂（水貂肠炎病毒 HI 抗体效价 14）4.2 试剂 DEPC 双蒸水（双蒸馏水 1000 mL、DEPC 1 mL，室温放置 28 h 以上，0.105 MPa 蒸汽高压30 min。DB22/T 25602016 2 4 或室温保存）培养液（DMEM 粉10 g、碳酸氢钠 3.7 g，溶于1000 mL 双蒸水中，抽滤分装，4 保存）营养液（DMEM培养液900 mL、犊牛血清100 mL，加青霉素、链霉素，使其浓度分别达到200 IU/mL、200 g/mL 抽滤除菌）维持液（DMEM 培养液980 mL、犊牛血清 20 mL，加青霉素、链霉素使其终浓度分别达 200 IU/mL、200 g/mL，抽滤除菌）胰蛋白酶溶液（胰酶 2.50 g、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）0.20 g、无钙镁 PBS 1000 mL，抽滤除菌，4 保存备用）新生犊牛血清 青霉素 链霉素 阿氏液（葡萄糖 2.05 g、拘椽酸钠 0.8 g、柠檬酸 0.055 g、氯化钠 0.82 g、双蒸馏水二级水中溶解后，用盐酸将 pH 值调至 6.1，高压蒸汽灭菌 20 min，最后用二级水定容至 100 mL，4保存备用。）蛋白酶 K（三羟甲基氨基甲烷（Tris）（pH 7.8）1.20 mg（0.01 mmol/L）、乙二胺四乙酸（EDTA）1.86 mg（0.005 mmol/L）、SDS 5.00 g、三蒸水 1 000 mL、加入蛋自酶 K，使成为20 mg/mL，即为贮存液；使用浓度为50 g/mL）RNase A（20 g/mL，10 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）1.21 g、15 mmol/L NaCl 0.89 g、RNase A 0.02 g，加去离子水使其终浓度为 20 g/mL。分装，20 保存备用）Tris 饱和酚 酚氯仿异戊醇（25241）无水乙醇 70%乙醇 TE（pH 8.0）（10 mmol/L Tris-Cl（pH 8.0）1.21 g、l mmol/L EDTA（pH 8.0）0.37 g、去离子水 800 mL，调节 pH至 8.0，用去离子水定容至 1000 mL）Taq DNA 聚合酶（5 U/L）dNTPs（每种浓度均为 10 mmol/L）RNasin（40 U/L）MgCl2（15 mmol/L）琼脂糖（电泳级）DNA Marker DL 2000 50Tris-冰乙酸（TAE）电泳缓冲液（Tris 282.0 g、冰乙酸 57.10 g、0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）100 mL，三蒸水定容至 1000 mL，0.105 MPa蒸汽高压 30 min，备用）溴化乙锭溶液（10 mg/mL）（三蒸水 100 mL、溴化乙锭 1 g，置棕色瓶中，磁力搅拌数小时以确保其完全溶解，然后用铝箔包裹容器保存于室温）1%琼脂糖凝胶（琼脂糖 1 g、TAE 电泳缓冲液（50 倍）2 mL、灭菌三蒸水 98 mL、微波炉中完全融化，加溴化乙锭溶液）SYBR Premix，商品化的荧光定量 PCR 试剂盒可以用来进行荧光定量 PCR反应体系的配制 F81 传代细胞 猪的红细胞：1%猪红细胞悬液（用 20 mL 注射器先吸取 5 mL 阿氏液，从健康猪耳静脉采血10 mL 左右立即混匀，用 pH 值 6.4 的 PBS 洗涤，3000 r/min 离心 5 min，弃掉上清，反复洗涤 3 次，直至离心后的 PBS 无血色，弃上清，取出红细胞泥 1 mL，加含 1%BSA 的pH值 6.4的 PBS 稀释液 9 mL，混匀后取 1 mL，稀释液 9 mL，即为 1%的猪红细胞悬液）DB22/T 25602016 3 阳性抗原：由指定单位提供或将水貂肠炎病毒疫苗毒 MEV B株通过 F81传代细胞培养，其培养物经过灭活制备而成 阴性抗原：由指定单位提供或将生长良好的 F81 传代细胞，冻融 23 次，5000 r/min离心10 min，取上清液备用 阳性血清：由指定单位提供或用水貂肠炎病毒疫苗株的细胞培养物免疫水貂后分离血清制成，或采已知水貂肠炎病毒抗体阳性貂血分离而成 引物：根据 MEV 国际标准株 Abashiri 基因序列，在其保守基因序列内设计合成一对特异性引物：引物 P1：5 ACAAGCGGCAAGCAATCCTC 3，引物P2：5 CTGCCTCTATTTCGGACCAT 3，配制成 20 pmol/L。20 保存 5 设备 生物安全柜 CO2培养箱 倒置显微镜 高速冷冻离心机 组织匀浆器 4 冰箱 超低温冰箱 PCR 扩增仪 电泳仪 电泳槽 凝胶成像分析系统 荧光定量 PCR 仪 旋涡振荡器 移液器（20 L、200 L、1000 L）8 通道移液器（100 L）6 病毒分离鉴定 6.1 病料采集与处理 无菌取病貂的肠道组织或粪便2 g，按1:10的比例用培养液制成匀浆，反复冻融三次，3000 r/min离心20 min，取上清液经0.22 m微孔滤膜过滤，加入抗生素至终浓度为青霉素2000 IU/mL，链霉素2000 g/mL，37 感作1 h，冷藏备用。6.2 病料接种 将处理过的样品同步接种F81细胞，接种量为营养液量的10%，加入营养液，然后37 恒温培养箱中吸附24 h后，倾去营养液加入维持液，置37 的5%CO2恒温培养箱中培养4 d6 d，同时设置正常细胞对照。6.3 病变观察 DB22/T 25602016 4 接种24 h后置显微镜下逐日观察至4 d6 d。正常细胞对照成立，接种病料的细胞出现细胞变圆、拉网、脱落等CPE，收获细胞培养物，放入80 冰箱中保存备用。对照细胞与接种样品细胞均无变化，应盲传3代。盲传过程中出现CPE，按上述原则，收获细胞培养物，放入80 冰箱中保存备用；若盲传3代未出现CPE，则按未分离到水貂肠炎病毒出具结果。6.4 病毒鉴定 取上述细胞培养物进行HA-HI试验、PCR、荧光定量PCR和动物回归试验等鉴定。7 HA-HI 试验 7.1 样品采集与处理 7.1.1 组织与粪便 无菌取病貂的肠道组织或粪便2 g，按1:20的比例用培养液制成匀浆，反复冻融三次，3000 r/min离心20 min，取上清液经0.22 m微孔滤膜过滤，加入抗生素至终浓度为青霉素2000 IU/mL，链霉素2000 g/mL，冷藏备用。7.1.2 血清制备 趾尖采血，室温静置1 h后4 冰箱过夜，吸出血清入离心管中，3000 r/min离心5 min，取上清液备用。7.2 HA 试验 7.2.1 加样步骤 在微量板上，从第1孔至10孔以及12孔，用移液器每孔加入pH 6.4 10 mM的PBS 25 L，用移液器吸取7.1.1待检样品25 L，从第1孔起，依次作倍比稀释，至第10孔，弃去移液器内25 L液体（稀释倍数依次为2、4、8、16、32 1024），11孔为病毒对照，12孔为红细胞对照。第1孔至12孔每孔补加pH 6.4的 PBS 25 L，再加入1%猪红细胞悬液50 L，立即在微量板振荡器上摇匀后放置4 静置 60 min 判定结果。加样示意图参见附录A.1。7.2.2 结果判定 使50 红细胞凝集的最高稀释度，作为病毒的HA效价；HA效价1:8则判定为HA阳性，反之则为阴性。7.3 HI 试验 7.3.1 4 个单位血凝素的配制 病毒HA效价（如为1256），4个血凝工作单位=256/4=64（即164），取pH 6.4的 PBS 9 mL，加血凝素 l mL，即成1:10稀释度，将1:10稀释液l mL加入到生理盐水5.4 mL中，使最终浓度为1:64。7.3.2 加样步骤 将待检血清用pH 6.4的PBS进行2倍系列稀释，加入含4单位血凝素的抗原液，并设红细胞对照和病毒对照，充分振摇后，置37 作用30 min后，加入1%红细胞悬液，4 静置60 min，判定结果。加样示意图参见附录A.2。DB22/T 25602016 5 7.3.3 判定标准 以使红细胞凝集被完全抑制的血清最高稀释度作为判定终点，该最高稀释度即为被检血清的HI效价。8 PCR 8.1 DNA 提取 取6.1中处理样品200 L，或取病毒细胞培养液200 L，20/室温反复冻融23次，12 000 r/min离心l0 min；将上清液转入另一离心管中，加入等体积的消化缓冲液及5 L蛋白酶K（20 mg/mL）50消化2 h，12 000 r/min离心10 min；将上清液转移到一新的离心管中，加入等体积的Tris饱和酚，充分振荡混匀，12 000 r/min离心l0 min；取上层水相转移入一新的离心管中，加入等体积的酚氯仿异戊醇（25241）混匀后，12 000 r/min离心l0 min（重复此步骤一次）；取上层水相转移入一新的离心管中，加入2倍体积预冷的无水乙醇，在20 放置1 h2 h或室温放置30 min以沉淀病毒DNA；12 000 r/min离心l0 min，弃去上清，用70%乙醇洗涤沉淀，自然风干；用10 L含RNase A（20 g/mL）的TE（pH 8.0）溶解沉淀，20 保存备用。或按照市售的DNA抽提试剂盒操作说明提取病毒DNA。8.2 PCR 扩增 8.2.1 反应体系 表1 PCR 反应体系 成分 用量（L）10PCR buffer 2.5 20 mmol/L dNTPs 1.0 20 pmol/L 引物P1 1.0 20 pmol/L 引物P2 1.0 MEV DNA 2.0 Ex Taq DNA 聚合酶 0.2 灭菌水 17.3 总体积为25 L体系，用漩涡混匀器进行混匀，瞬间离心，备用。8.2.2 扩增程序及反应条件 将PCR反应管置于PCR扩增仪。反应参数为：94 预变性5 min；再进行94 变性30 s、56 退火30 s、72 延伸30 s，31个循环；然后72 延伸5 min，最后4 保存。PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析。8.3 PCR 产物的电泳检测 用TAE电泳缓冲液配制成1%琼脂糖平板（溴化乙锭终浓度0.5 g/mL）。将平板放入水平电泳槽中，加入1TAE电泳缓冲液刚刚高出凝胶表面，将PCR扩增产物5 L与1 L 6上样缓冲液混合，分DB22/T 25602016 6 别加入样品孔中，取5 L DNA Marker DL 2000加入到标准分子量对照孔内。5 V/cm恒压电泳30 min45 min。8.4 结果判定 8.4.1 用凝胶成像系统进行分析，在阴性和阳性对照成立情况下，如被检样品无条带，则结果为阴性，如被检样品有条带，大小为 194 bp，即判定为水貂肠炎病毒核酸阳性。必要时取 PCR 扩增产物进行序列测定，进一步确认待测样品的结果。8.4.2 如果出现与设计长度不同的条带，为非特异性反应，需重复试验，两次试验均为非特异性反应时，可判为阴性。9 Real-time PCR 9.1 DNA 提取 按照6.1或按照DNA抽提试剂盒操作说明提取病毒DNA。9.2 荧光PCR 检测 9.2.1 反应体系 表2 反应体系 成分 用量（L）SYBR Premix 10 20 pmol/L 引物P1 0.5 20 pmol/L 引物P2 0.5 MEV DNA 2.0 PCR-grade water 7.0 Total Volume 20.0 总体积为20 L体系，用漩涡混匀器进行混匀，瞬间离心，备用。9.2.2 反应参数 在检测区进行，将9.2.1中加样后的PCR管放入荧光定量PCR检测仪内，记录样本摆放顺序。反应参数设置见表3 DB22/T 25602016 7 表3 反应参数设置 步骤 阶段 温度（C）时间（s）收集信号 循环数 1 预变性 95 30 否 1 2 变性 复性 扩增 94 54 5 30 否 是 40 3 熔解 6095 1200 是 1 9.3 结果分析 9.3.1 扩增分析 设置阈值：确认阈值线位于指数增长阶段；设置基线：确定PCR扩增曲线的最小Ct值，然后将基线的范围设定在最小Ct值减去3；保存设置，用样品名作为文件名，将数据输出为Excel文件。9.3.2 熔点曲线分析 熔点曲线：大多数实时荧光定量PCR仪，当在SYBR Green模式下运行时，会自动进行熔点曲线分析；熔点曲线分析：每一反应孔的熔点曲线分析所得到的熔点温度“Tm”值（参照资料性附录B.2）。9.3.3 质控标准 阴性对照无Ct值并且无扩增曲线和熔点曲线；阳性对照的Ct值应30.0，并出现特定的扩增曲线和熔点曲线；如阴性对照和阳性对照条件不满足以上条件，此试验视为无效。9.3.4 结果描述及判定 无Ct值并且无扩增曲线和熔点曲线，表明样品中无水貂肠炎病毒核酸；Ct30.0，且出现特定的扩增曲线和熔点曲线，表示样品中存在水貂肠炎病毒核酸。10 动物回归试验 10.1 动物感染试验 选择水貂肠炎病毒HI抗体效价 14 的3月龄的健康水貂10只，分两组每组5只，人工感染组5只经胃管灌服分离鉴定获得的病毒液8 mL/只，腹腔注射2 mL/只。对照组5只，每只灌服注射相同体积的细胞培养物，分别隔离观察饲养10 d，每天观察试验及对照水貂的临床症状，测定体温；并于接种第3 d开始收集水貂粪便，按照7中步骤进行MEV的HA检测。10.2 结果判定 10.2.1 感染动物临床观察评分标准 评分标准见表4。DB22/T 25602016 8 表4 评分标准 临床观察项目 赋分值 发病死亡 5 腹泻，粪便稀软、呈黄色、灰白色或粉红色甚至煤焦油状 4 体温升高至40 以上，并持续2 d以上 1 精神沉郁，食欲减退或废绝 1 粪便HA效价1:8 1 10.2.2 判定标准 对照组动物无10.2.1描述的任何症状，试验组动物分数5时判定感染成功，每次接种5只水貂，发病3只及以上认为回归成功。DB22/T 25602016 9 A A 附 录 A（规范性附录）加样示意图 A.1 HA试验加样示意图 单位：微升（L）V 型血凝板各孔 V 型血凝板样品 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 病毒对照 细胞对照11 12 样品稀释倍数 12 14 18 116 132 164 1128 1256 1512 11024 PBS（pH 6.4）25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 0 25 25 待检样品 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 0 PBS（pH6.4）25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 1%猪红细胞悬液 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 图A.1 HA 试验加样示意图 A.2 HI试验加样示意图 单位：微升（L）V型血凝板各孔 V型血凝板样品 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 病毒对照 细胞对照 11 12 稀释倍数 12 14 18 116 132 164 1128 1256 1512 11024 PBS（pH 6.4）25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 50 25 待检血清 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 4 单位血凝素 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 1%猪红细胞悬液 50 50 50 50 50 50 50 50 50 25 50 50 图A.2 HI 试验加样示意图 DB22/T 25602016 10 B B 附 录 B（资料性附录）PCR 与荧光PCR 扩增序列及熔点曲线 B.1 PCR与荧光PCR扩增序列 ACAAGCGGCAAGCAATCCTCAGAGTCAAGACCACGTTCTAACTCCTCTGACTCCGGACGTAGTGGACCTTGCACTGGAACCGTGGAGTACTCCAGATACGCCTATTGCAGAAACTGCAAATCAACAATCAAACCAACTTGGCGTTACTCACAAAGACGTGCAAGCGAGTCCGACATGGTCCGAAATAGAGGCAG B.2 荧光PCR熔点曲线 _