水禽1型甲肝病毒亚型感染诊断技术DB35／T 1621-2016.pdf

ICS 11.220 B 41 DB35 福建省地方标准 DB35/T 1621 2016 水禽1 型甲肝病毒 亚型感染 诊断技术 Diagnostic Protocol for subtype of duck hepatitis A virus type-1 infection in waterfowl 2016-12-30 发布 2017-04-01 实施 福 建 省 质 量 技 术 监 督 局 发布 DB35/T 16212016 I 目 次 前言.II 1 范围.1 2 疫 病概 述.1 3 临 床诊 断.1 4 反 转录-聚合 酶链 式反 应（RT-PCR）诊断.2 附录 A（规范 性附 录）相关试 剂的 配制.4 附录 B（资 料 性附 录）RT-PCR 检测 结果 电泳 图例.6 附录 C（资料 性附 录）水禽 1 型甲 肝病 毒亚 型VP1 基因 序列.7 DB35/T 16212016 II 前 言 本标准 按照GB/T 1.12009 标 准化 工作 导则 第1 部 分：标 准的 结构 和编 写 给出的 规则 起草。本标准 由福 建省 农业 科学 院提出。本标准 由福 建省 农业 厅归 口。本标准 起草 单位：福 建省 农业科 学院 畜牧 兽医 研究 所、福 建出 入境 检验 检疫 局检验 检疫 技术 中 心。本标准 主要 起草 人：黄瑜、傅光 华、傅秋 玲、白泉 阳、施 少华、程 龙飞、万 春和、陈红 梅、陈珍、朱春华、陈 翠腾、刘 荣昌、潘飞 龙。DB35/T 16212016 1 水禽1 型 甲肝病毒 亚型感 染诊断技 术 1 范围 本 标 准 规定 了 水禽1 型甲 肝病 毒 亚 型感 染 的临 床诊 断要 点 及 病毒 核 酸检 测的 反转 录-聚合 酶 链式 反应（RT-PCR）的操 作技 术 规程。本标准 适用 于水 禽1 型甲 肝 病毒亚 型感 染的 临床 诊断 和实验 室诊 断。2 疫病概 述 水禽1型 甲肝 病毒亚 型感染，俗称 水禽胰 腺炎，是由 不同于 致雏鸭 典型 肝炎（肝脏肿 大、出 血）的鸭1型 甲肝 病毒（DHAV-1）的 鸭1 型 甲肝 病毒 亚型（DHAV-1a）引起 雏鸭（鹅）胰 腺发 黄、出血 为特 征的新发 疫病。该病最 早于2011 年9 月发 生 于我国 福建、浙江 两省的 雏番鸭 群，一 年四 季均有 发生，其发病 率和 病死 率 分 别为30%43%、60%78%不等。其全 基 因组 序 列 与经 典 的肝 炎 型DHAV-1 参 考 毒 株 核苷 酸 序列 和 氨 基 酸 同源 性 分 别 介于93.5%99.6%和97.9%99.6%之 间，与 经 典 的肝 炎 型DHAV-1 间 的 抗 原亲缘值（R）为0.62（介于0.32 0.70 间）；其特 征性 剖 检病变 为胰 腺发 黄、出血，完全 不同 于引 起典 型肝炎的DHAV-1所致 的肝 脏 肿大、出血 特征 病变，且 在易感 动物 上也 存在 明显 差异，雏番 鸭、雏半 番鸭 和雏鹅对 该病 较易 感、北京 樱桃谷 雏鸭 和雏 麻鸭 对该 病不易 感，而经 典的 肝炎 型DHAV-1 却反之。3 临床诊 断 3.1 临床症 状 当雏鸭（鹅）出 现以 下部 分或全 部临 床症 状时，可 作为初 步诊 断的 依据：a)采食或（和）饮 水量 下降；b)表现沉 郁或 扎堆；c)出现死 亡。3.2 剖检病 变 当雏鸭（鹅）出 现以 下肉 眼剖检 病变 时，可作 为初 步诊断 的依 据：病死雏 鸭（鹅）胰腺 发黄 或（和）存在 散 在出 血点 或（和）出 血灶。3.3 初步诊 断 当雏鸭（鹅）出 现3.1 描述 的部分 或全 部临 床症 状或（和）3.2 描 述的 剖检 病变 时，可 作出 初步 诊断；确切诊 断 需 通过 实验 室 做 进一步 检测。DB35/T 16212016 2 4 反转录-聚 合酶 链式 反应（RT-PCR）诊 断 4.1 样品采 集与 处理 尽量采 集发 病、濒死 或病 死雏鸭（鹅）的胰 腺组 织 样品，尽快 处理，即将 采 集的组 织样 品剪 碎，与磷酸盐缓冲液（PBS，配 制 方 法 见 附 录A.1）按 照 体 积 比1:3 的 比 例 制 成 组 织 匀 浆 液，反 复 冻 融3 次，8 000 r/min 离心30 min，取上清，用于RNA 抽 提，或 置-20 冻存 备用。若 在6 h以上 处理 的样 品，应先置-20 条件 下保 存备 用，需托运 时应 确保 冷藏 或冰 冻状态 运输。4.2 仪器设 备 4.2.1 PCR 仪。4.2.2 高速台 式冷 冻离 心机。4.2.3 微量移 液器。4.2.4 组织匀 浆器。4.2.5 电泳仪。4.2.6 电泳槽。4.2.7 紫外凝 胶成 像系 统。4.3 试剂 4.3.1 RNA 提取 试剂 Trizol。4.3.2 三氯甲 烷。4.3.3 异丙醇。4.3.4 焦炭酸 二乙 酯（DEPC）处 理水：配制 方法 见附 录 A.2。4.3.5 75%乙 醇：配制 方法 见附 录 A.3。4.3.6 溴化乙 锭溶 液：配制 方法 见附 录 A.4。4.3.7 1 TAE 缓 冲液：配 制方 法 见附 录 A.5。4.3.8 1.0%琼 脂糖 凝胶：配 制方 法见附 录 A.6。4.3.9 DNA 相 对分 子质量 标准 物：DL2000。4.3.10 10 加样 缓冲 液：配制 方法 见附 录 A.7。4.4 引物 根 据 水 禽（鸭、鹅）DHAV-1a VP1 基 因 保 守 区 特 征 设 计 特 异 性 引 物，上 游 引 物 F：5-GGTGATTCCAACCAGTTAGGGGAT-3 和 下游引 物R：5-TTCAATTTCCAGGTTGAGTTCA-3，用于扩增目 的条 带约700 bp大 小的VP1 基因 片段。上、下游引 物的 使用 浓度 均为 20 pmol/L。4.5 病毒RNA 提取 病毒RNA 提取 方法 如下：a)取 250 L 组织匀浆 上清 液 加入 1.5 mL 灭菌离心管 后，加 入 750 L RNA 提取 试剂 Trizol，充分混 匀 15 s，再 加入 200 L 预冷的三氯 甲烷 后，充 分倒置 混匀，室 温静 置 10 min。b)4 条 件下，12 000 r/min 离心 15 min。取经 DEPC 处理水 处理 的 1.5 mL 灭菌离心管，小心 吸取离心 上清 液 600 L，加 入等体 积-20 预 冷的 异丙 醇，反 复颠 倒混 匀。c)4 条 件下，12 000 r/min 离心 15 min。轻轻 倾倒 上 清液，加 入 800 L 75%乙 醇清 洗 2 次，倒置于吸 水纸 上 5 min，室 温 晾干。DB35/T 16212016 3 d)加入 20 L DEPC 处 理水，轻轻混 匀溶 解离 心管 壁上 核酸 RNA，2 000 r/min 离心 30 s，提取 的RNA 应在 2 h 内进 行 RT-PCR 扩增 或保 存于-20 冰箱 备用。也可采 用市 售商 品化 的等 效核酸RNA 提 取试 剂盒，完成核 酸RNA 提取。4.6 对照 以 灭 活 的水 禽（鸭、鹅）1型 甲 肝 病毒 亚 型作 为阳 性对 照，以灭 活 的禽1 型副 黏病 毒 基 因组 或 其他RNA 样品 作为 阴性 对照，以无DNase 和RNase 的灭 菌 水作为 空白 对照。4.7 RT-PCR 反应 RT-PCR 反 应体 系为25 L，每个 反应 管的 反应 液配 置为：依次 加入15 L DEPC 处 理水，2.5 L 反转录酶缓 冲液，2.5 L Taq 聚 合酶缓 冲液，0.5 L dNTP（2.5 mM/L each），0.5ul AMV 反转 录酶（5 U/uL），0.5 L Taq DNA 聚合 酶（1 U/uL），0.5 L RNA 酶 抑制剂（20 U/uL），2条 引物各0.5 L，对 应样 品的RNA 3 L。2 000 r/min离心15 s，使 反应 混合 液都 沉 降到PCR 管 底。将上 述混 合物按 照以 下步 骤进 行一步法RT-PCR：第一 步42，30 min；第二 步是PCR 循 环，95 预热3 min，循环 参数为：94、1 min，56、1 min，72、1 min，循 环30 次；第三 步72 延伸8 min 结束。也可采 用市 售商 品化 的等 效RT-PCR 检测 试剂 盒，并 按照剂 盒推 荐的 条件 进行。4.8 RT-PCR 产 物电 泳 反应结 束后，各 检测 样品、阴性 对照 样品、阳 性对 照样品 和空 白对 照样 品均 分别取5 L RT-PCR 产物与0.5 L 加样缓冲 液混 合，然后 加入 到1.0%琼脂 糖 凝胶板 的加 样孔 中，同时 加 上DNA 分 子量 标准5 L；以5 V/cm 的电压进 行电 泳，30 min 后在紫 外凝 胶成 像系统 观察 结果。4.9 结果判 定 当阳性 对照 样品 出现700 bp 左右 特异 性条 带（见 附录B 电 泳图2 号泳 道），阴性 对照样 品和 空白 对照样品均 无特 异性 扩增 条带（见 附录B 电 泳图5 号、6号 泳道），本次 实验 结果 成 立有效；当待 检样 品出 现700 bp 左右 特异 性条 带（见附录B 电泳 图3号 泳道）判为阳 性样 品，无特 异性 扩增条 带（见附 录B 电泳 图4号泳 道）判为 阴性 样品。必要时，可 将PCR 扩 增产 物进行 测序，并 与参 考序 列（见 附录C）比 对。DB35/T 16212016 4 A A 附 录 A（规范 性附 录）相关试 剂的 配制 A.1 0.01 M 磷 酸盐 缓冲 液（PBS）NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO4 12H2O 2.9 g KH2PO4 0.2 g 将上述 试剂 溶于800 mL 灭 菌双蒸 水中，定容 至1 000 mL，1.034 105 Pa 高 压灭 菌30 min，4 保存 备用。A.2 焦炭酸 二乙 酯（DEPC）处 理水 于三蒸 水按0.1%加入DEPC，室温 静置 过夜，1.034 105 Pa 高 压灭 菌20 min，冷 却备用。A.3 75%乙醇 取无水 乙醇750 mL 加入灭菌双蒸 水250 mL，定容至1 000 mL，-20 保存备 用。A.4 溴化乙 锭（EB）溶液 溴化乙 锭 20 mg 灭菌双 蒸水 至20 mL 说明：也可 采用 市售 商品 化的更 环保、更 安全Goldviewer 等荧光 染料。A.5 1TAE 电 泳缓 冲液 A.5.1 配制0.5 mol/L 乙二 铵四 乙 酸二钠（EDTA）溶液（pH8.0）二水乙 二铵 四乙 酸二 钠 18.61 g 氢氧化 钠 调pH 至8.0 灭菌双 蒸水 至100 mL A.5.2 配制50TAE 电 泳缓 冲液 羟基甲 基氨 基甲 烷（Tris）242 g 冰乙酸 57.1 mL 0.5 mol/L 乙二铵四乙 酸二 钠溶液（pH8.0）100 mL 灭菌双 蒸水 至1 000 mL 用时用 灭菌 双蒸 水稀 释50 倍使用。DB35/T 16212016 5 A.5.3 配制1TAE 电 泳缓 冲液 50 TAE 电泳 缓冲 液 20 mL 灭菌双 蒸水 至1 000 mL A.6 1.0%琼脂 糖 凝胶 琼脂糖 1.0 g 1 TAE 电 泳缓 冲液 至100 mL 置微波 炉中 加热 至完 全融 化，待 冷至50 60 时，加溴 化乙 锭（EB）溶液5 L，摇匀后倒 入制胶板中，待 完全 凝固 后取 下加样 梳，备用。A.7 10 加样 缓冲 液 聚蔗糖 25 g 溴酚蓝 0.1 g 二甲苯 青 0.1 g 灭菌双 蒸水 至100 mLDB35/T 16212016 6 B B 附 录 B（资料 性附 录）RT-PCR 检 测结 果电 泳图 例 水禽（鸭、鹅）1型 甲肝 病 毒RT-PCR 检测 结果 电泳 图 见图B.1。说明：1DNA 分子量标尺；2 阳性对照扩增结果；3 待检样品（阳性）扩增结果；4 待检样品（阴性）扩增结果；5 阴性对照；6 空白对照。图B.1 RT-PCR 检 测结 果电 泳图 DB35/T 16212016 7 C C 附 录 C（资料 性附 录）水禽 1 型甲 肝 病 毒亚 型 VP1 基因 序列 以下为 水禽1型 甲肝 病毒 亚 型VP1 基 因序 列，供比 对 参考。GGTGATTCCAACCAGTTAGGGGATGATGAACCAGTTTGCTTCCTGAATTTTGAGACAGCTAATGTCCCAATACAAGGTGAATCTCACACTCTTGTTAAACACCTGTTTGGGAGGCAGTGGTTGGTTAGGACTGTGCAACACGCTTCAACTGTGCAAGAGTTGGACCTCCAAGTTCCAGACAGAGGACATGCCTCTCTCATTCGGTTCTTTGCCTATTTTTCTGGAGAGATCATTCTTACCATTGTTAACAACGGTACTACACCAGCAATGGTAGCACATTCCTATTCTATGGATGATCTCAGCTCAGAGTATGCTGTTACAGCAATGGGAGGTGTGATGATTCCTGCTAATAGTGCCAAAAATATCTCTGTACCATTCTATTCTGTGACACCACTCAGGCCAACTCGACCAATTCCTGGCACATCAGAAGCAACCTTTGACAGGCTGTTCATGTGGACTCAATCAGGAAGTCTTTCAGTTTTTATGGGCCTCAAAAAGCCAGCTCTCTTTTTTCCACTCCCTGCTCCCACTTCCACAGCACTATCACGGGGATCTAATGGTGTTATTCCCACATTGGATCAGTCTGGAGATGAAGTAGATTGTCACTTTTGTGAAATTTGTTCTAAAATGAAGAGGATGTGGAAGCCAAGAGGGCACTTCAGATTTTGCCTTAGACTCAAAACACTAGCATTTGAACTCAACCTGGAAATTGAA _ DB35/T 1621 2016 1111 福 建 省 地 方 标 准 水禽 1 型甲 肝病 毒亚 型感 染诊断 技术 DB35/T 16212016*2017 年 6 月第一版 2017 年 6 月第一次印刷