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ICS 65.020.40 B 61 DB51 四川省地方标准 DB51/T 24032017 野生大熊猫粪便样品采集及DNA提取技术规程 2017-09-19发布 2017-10-01实施四川省质量技术监督局 发布 DB51/T 24032017 I 目 次 前 言.II 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 采样频次、时间和样线设计.1 5 粪便样品的采集和保存方法.2 附录 A（规范性附录）大熊猫粪便样品采集记录表.4 附录 B（规范性附录）四川各保护区大熊猫粪便样品编号.5 DB51/T 24032017 II 前 言 本标准根据 GB/T 1.1-2009标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写的规定编写。本标准由四川省林业厅提出并归口。本标准由四川省质量技术监督局批准。本标准起草单位：四川省野生动植物资源保护管理站 本标准主要起草人：岳碧松 魏辅文 张和民 沈富军 杨旭煜 古晓东DB51/T 24032017 1 野生大熊猫粪便样品采集及 DNA提取技术规程 1 范围 本标准规定了野生大熊猫新鲜粪便采集和 DNA 提取技术规程。本标准适用于四川省野生大熊猫新鲜粪便样品采集和DNA提取。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。DB51/T 2288-2016 野生大熊猫种群动态监测技术规程 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。3.1 大熊猫栖息地 habitats of giant panda 是指适合于大熊猫生活的环境范围。3.2 GIS Geographic Information System 地理信息系统 4 采样频次、时间和样线设计 4.1 采样频次与时间 野生大熊猫新鲜粪便样品采集可在春季化雪后（繁殖季节）和冬季积雪前（非繁殖季节）开展；对于交通比较方便的大熊猫分布密集区，可以根据具体情况和研究目标增加采样次数。各地可根据当地大熊猫的习性以及当地的物候、气候、大熊猫主食竹发笋规律、野外工作条件和后勤保障等因素，确定具体采样时间。野外采样工作应尽量在最短时间内完成，一般为10-15天。4.2 采样路线 以1:5万电子地图或遥感卫星图片为基本工作图，以全国第四次大熊猫调查结果为依据，采用GIS方法将保护区大熊猫栖息地划分为若干个面积为2 km2 的网格，每个网格作为1个采样小区，并编号。取样小区的划分尽量与全国第四次大熊猫调查保持一致。DB51/T 24032017 2 在单个小区内，根据地形、地貌、道路、河流、植被、大熊猫主食竹等因素，以最短的距离覆盖最多的生境类型为原则，布设实际采样路线，样线长度不得少于1.5 km，尽量形成“S”形或“Z”形路线。5 粪便样品的采集和保存方法 5.1 采样工具 手持终端设备、GPS定位仪、罗盘、地形图、记录表格、一次性PE手套、封口袋、500ml塑料样品瓶、无水乙醇、标记笔、铅笔、标签纸、标记胶带、GPS数码照相机等。5.2 粪便新鲜程度判定 以大熊猫粪便表面是否有粘液和粘液的光泽、粪便完整程度、颜色以及气味等判断大熊猫粪便的新鲜程度，其中以大熊猫粪便表面附有粘液为主要标准。1天以内：粪便颜色保持绿色或与调查季节竹子颜色相近、表面有明显粘液、且向光和贴近地面一侧的粘液光泽基本无差异。2-5天：粪便颜色与调查季节竹子颜色相近，表面有较多粘液，向光一面的光泽消失或不明显、贴近地面一侧的表面有光泽。6-10天：粪便颜色接近深绿色，表面有少量粘液，向光一面的表面无光泽。5.3 粪便样品的选取原则 应尽量采集5天以内的大熊猫新鲜粪便，在寒冷干燥季节，可采集6-10天的粪便样品。10天以上的粪便不采集。同一堆粪便只采集一份样品；当多堆新鲜粪便距离较近时，即使判定为同一只熊猫，也可采集多份样品，以增加DNA量，但需在记录表中加以注明。直线距离100 m以上的新鲜粪便都要进行采样，以确保DNA提取成功和充足的DNA量；若遇到大熊猫求偶交配场地（通常出现在3-5月），采集原则为近距离、高强度采样，即使粪堆较近，也应分别采集；若遇到疑似大熊猫母幼粪便样品，应分开采集粪便；依据母幼大熊猫粪便大小有明显差异作出判断。5.4 样品采集方法 采集大熊猫新鲜粪便样品时，应佩戴一次性PE手套。禁止直接用手拾取大熊猫粪便，以避免人为因素导致的样品污染；每次采样时必须更换新的PE手套，以避免样品间的交叉污染。直接剥取新鲜粪便的粘液表层放入盛有无水酒精的样品瓶中，拧紧瓶盖后上下用力摆动数次，使样品得到充分湿润，并检查是否有液体渗漏。贴上样品标签纸，写上样品编号和坐标，最后在样品瓶外套一层封口袋，并再次写上样品编号，以避免酒精漏出导致编号丢失。如果符合采样条件的粪便仅有少数几团时，应尽量多取一些粘液表层及浅层样品，确保能够获得充足的DNA量。如果符合采样条件的粪便是一堆或多堆时，应采集最新鲜和靠近中间的粪团样品，以避免边缘污染。同一堆粪便要尽量多取样品，如果样品瓶容量有限，可以在用力摆动洗脱后，用镊子取出大的粪便残渣，然后继续取样。5.5 样品记录与编号 DB51/T 24032017 3 在采集粪便样品的同时，应填写大熊猫粪便样品采集记录表（附录A）。记录采样坐标（采用十进制）、海拔、新鲜程度及生境状况。有条件的保护区可用手持移动终端录入电子信息表，自动记录坐标和海拔，并拍摄粪便照片和生境照片；用带有GPS的数码照相机拍摄清晰的带坐标的照片。粪便样品采集编号规则为：县名首写字母（三位）+保护区名首写字母（两位）+采样小区编号+样品号，如“PWX-WL-1-F1”表示平武县王朗第1号小区内采集的第1处粪便样品（附录B）。小区内采集的多个样品依次按照F1、F2、F3的顺序编号。晚上回到宿营地后，必须对当日采样记录进行整理，核对样品编号与记录表编号是否一致，检查记录内容是否完整无误，并及时纠正补充。5.6 样品的临时保存 野外样品采回后，应仔细检查核对标签和记录，并补充酒精量至样品完全浸没为宜。酒精中的样品可以室内常温保存；有条件时可进行冷藏或冷冻保存，直到样品送到相关实验室。5.7 样品的运输和实验室保存 野外样品采集完成后应于10日内送到相关分子生物学实验室进行保存，并尽快进行DNA提取工作；由于无水乙醇是易燃易爆的化学品，样品应通过专用汽车运送，并注意车内通风，禁止车内吸烟。运输过程中样品应远离火源，避免挤压。样品DNA提取和保存方法 5.8 粪便样品的 DNA提取 从大熊猫粪便中提取DNA，推荐使用粪便DNA提取专用商品试剂盒，具体方法参考试剂盒使用说明。5.9 DNA的保存 将装有总DNA的离心管保存在-20 冰箱备用；或在-80 超低温冰箱中长期保存。DB51/T 24032017 4 A A 附 录 A（规范性附录）大熊猫粪便样品采集记录表 保护区大熊猫粪便样品采集记录表 采样人：采样日期：天气：小区 编号 样品编号 新鲜度（天）北纬（十进制）东经（十进制）海拔(m)取样 团数 生境简述 1 F01 F02 2 F01 F02 DB51/T 24032017 5 B B 附 录 B（规范性附录）四川各保护区大熊猫粪便样品编号 保护区名称 市县名 编号 四川千佛山国家级自然保护区 安县 AX-QFS-四川蜂桶寨国家级自然保护区 宝兴县 BXX-FTZ-四川小寨子沟国家级自然保护区 北川县 BCX-XZZ-四川片口自然保护区 北川县 BCX-PK-四川鞍子河自然保护区 崇州市 CZS-AZH-四川黑水河自然保护区 大邑县 DYX-HSH-四川龙溪-虹口国家级自然保护区 都江堰市 DJY-LXHK-四川黑竹沟国家级自然保护区 峨边县 EBX-HZG-四川马鞍山大熊猫自然保护区 甘洛县 GLX-MAS-四川贡嘎山国家级自然保护区 甘孜州 GZZ-GGS 四川瓦屋山自然保护区 洪雅县 HYX-WWS-四川金口河八月林大熊猫保护区 金口河区 JKH-BYL-四川湾坝自然保护区 九龙县 JLX-WB-四川九寨沟国家级自然保护区 九寨沟县 JZX-JZG-四川白河自然保护区 九寨沟县 JZG-BH-四川勿角自然保护区 九寨沟县 JZG-WJ-四川贡杠岭自然保护区 九寨沟县 JZG-GGL-四川麻咪泽自然保护区 雷波县 LBX-MMZ-四川米亚罗自然保护区 理县 LX-MYL-四川马边大风顶国家级自然保护区 马边县 MBX-DFD-四川宝顶沟自然保护区 茂县 MX-BDG-四川九顶山自然保护区 茂县 MX-JDS-四川美姑大风顶国家级自然保护区 美姑县 MGX-DFD-四川冶勒自然保护区 冕宁县 MNX-YL-四川芹菜坪自然保护区 沐川县 MCX-QCP-四川白水河国家级自然保护区 彭州市 PZS-BSH-四川王朗国家级自然保护区 平武县 PWX-WL-四川雪宝顶国家级自然保护区 平武县 PWX-XBD-四川小河沟自然保护区 平武县 PWX-XHG-四川余家山自然保护区 平武县 PWX-YJS-四川老君山国家级自然保护区 屏山县 PSX-LJS-四川唐家河国家级自然保护区 青川县 QCX-TJH-四川东阳沟自然保护区 青川县 QCX-DYG-四川毛寨自然保护区 青川县 QCX-MZ-DB51/T 24032017 6 保护区名称 市县名 编号 四川包座自然保护区 若尔盖县 REG-BZ-四川栗子坪国家级自然保护区 石棉县 SMX-LZP-四川白羊自然保护区 松潘县 SPX-BY-四川龙滴水自然保护区 松潘县 SPX-LDS-四川黄龙自然保护区 松潘县 SPX-HL-四川喇叭河自然保护区 天全县 TQX-LBH-四川卧龙国家级自然保护区 汶川县 WCX-WL-四川草坡自然保护区 汶川县 WCX-CP-四川四姑娘山国家级自然保护区 小金县 XJX-SGL-四川大相岭自然保护区 荥经县 YJX-DXL-四川羊子岭自然保护区 雨城区 YCQ-YZL-四川申果庄省级自然保护区 越西县 YXX-SGZ-_ DB51/T 24032017
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