暗褐脉柄牛肝菌菌种生产技术规程DB53／T 1229-2025.pdf

ICS 6 5.0 2 0.0 1CCS B 0 553云 南 省 地 方 标 准DB53/T 1 2 2 9 2 0 2 4暗 褐 脉 柄 牛 肝 菌 菌 种 生 产 技 术 规 程2 0 2 4-0 3-0 1 发 布 2 0 2 4-0 6-0 1 实 施云 南 省 市 场 监 督 管 理 局 发 布D B 5 3/T 1 2 2 9 2 0 2 4I前 言本 文 件 按 照 G B/T 1.1 2 0 2 0 标 准 化 工 作 导 则 第 1 部 分：标 准 化 文 件 的 结 构 和 起 草 规 则 的 规 定起 草。请 注 意 本 文 件 的 某 些 内 容 可 能 涉 及 专 利。本 文 件 的 发 布 机 构 不 承 担 识 别 专 利 的 责 任。本 文 件 由 景 洪 宏 臻 农 业 科 技 有 限 公 司 提 出。本 文 件 由 云 南 省 农 业 标 准 化 技 术 委 员 会（Y N T C 0 7）归 口。本 文 件 起 草 单 位：景 洪 宏 臻 农 业 科 技 有 限 公 司。本 文 件 主 要 起 草 人：纪 开 萍、曹 旸、纪 光 燕、王 秋 兰、罗 顺 珍、高 丽 霞、纪 光 玉、晏 汐 蓓、陶 玲。D B 5 3/T 1 2 2 9 2 0 2 41暗 褐 脉 柄 牛 肝 菌 菌 种 生 产 技 术 规 程1 范 围本 文 件 规 定 了 暗 褐 脉 柄 牛 肝 菌（P h l e b o p u s p o r t e n t o s u s（B e r k.&B r o o m e）B o e d i j n）菌 种 的 生产 条 件、工 艺 流 程、母 种 制 备、药 瓶 液 体 菌 种 制 备、发 酵 罐 液 体 菌 种 制 备、栽 培 种 制 备、记 录 与 档 案、标 志、包 装、运 输。本 文 件 适 用 于 暗 褐 脉 柄 牛 肝 菌 菌 种 生 产。2 规 范 性 引 用 文 件下 列 文 件 中 的 内 容 通 过 文 中 的 规 范 性 引 用 而 构 成 本 文 件 必 不 可 少 的 条 款。其 中，注 日 期 的 引 用 文 件，仅 该 日 期 对 应 的 版 本 适 用 于 本 文 件；不 注 日 期 的 引 用 文 件，其 最 新 版 本（包 括 所 有 的 修 改 单）适 用 于 本文 件。G B 4 8 0 6.7 食 品 安 全 国 家 标 准 食 品 接 触 用 塑 料 材 料 及 制 品G B 5 7 4 9 生 活 饮 用 水 卫 生 标 准G B 1 4 8 8 1 食 品 安 全 国 家 标 准 食 品 生 产 通 用 卫 生 规 范G B 5 0 0 7 3 洁 净 厂 房 设 计 规 范N Y/T 5 2 8 食 用 菌 菌 种 生 产 技 术 规 程D B 5 3/T 4 9 1 暗 褐 网 柄 牛 肝 菌 菌 种3 术 语 和 定 义下 列 术 语 和 定 义 适 用 于 本 文 件。3.1暗 褐 脉 柄 牛 肝 菌 p h l e b o p u s p o r t e n t o s u s又 名 暗 褐 网 柄 牛 肝 菌，拉 丁 文 学 名 P h l e b o p u s p o r t e n t o s u s(B e r k.&B r o o m e)B o e d i j n，商 品 名黑 牛 肝 菌，隶 属 于 牛 肝 菌 目 B o l e t a l e s、小 牛 肝 菌 科 B o l e t i n e l l a c e a e、脉 柄 牛 肝 菌 属 P h l e b o p u s。3.2暗 褐 脉 柄 牛 肝 菌 菌 种 p h l e b o p u s p o r t e n t o s u s s p a w n暗 褐 脉 柄 牛 肝 菌 菌 丝 体 及 其 生 长 基 质 组 成 的 液 体 和（或）固 体 繁 殖 材 料，包 括 母 种、摇 瓶 液 体 菌 种、发 酵 罐 液 体 菌 种、栽 培 种。3.3母 种 s t o c k c u l t u r e经 组 织 分 离、菌 种 选 育 等 方 式 获 得 的，以 玻 璃 试 管 或 培 养 皿 为 培 养 容 器，培 养 基 质 为 营 养 液 添 加 琼脂 制 成 的 固 体 培 养 基，具 有 结 实 性 的 菌 丝 体 纯 培 养 物 及 其 继 代 培 养 物。3.4摇 瓶 液 体 菌 种 c o n i c a l f l a s k l i q u i d s p a w n由 母 种 扩 繁 而 得 的，以 摇 瓶 为 培 养 容 器，培 养 基 质 为 营 养 液，具 有 结 实 性 的 菌 丝 体 纯 培 养 物。3.5发 酵 罐 液 体 菌 种 f e r m e n t e r l i q u i d s p a w nD B 5 3/T 1 2 2 9 2 0 2 42由 摇 瓶 液 体 菌 种 扩 繁 而 得 的，以 发 酵 罐 为 培 养 容 器，培 养 基 质 为 营 养 液，具 有 结 实 性 的 菌 丝 体 纯 培养 物。3.6栽 培 种 c u l t i v a t e d s p a w n由 母 种、摇 瓶 液 体 菌 种 或 发 酵 罐 液 体 菌 种 等 扩 繁 而 得 的，以 一 定 容 量 的 瓶 子 或 袋 子 为 培 养 容 器，培养 基 质 为 富 含 木 质 纤 维 素 或 谷 物 粒 等 天 然 有 机 物 添 加 营 养 液，具 有 结 实 性 的 菌 丝 体 纯 培 养 物。4 生 产 条 件4.1 人 员人 员 应 符 合 G B 1 4 8 8 1 中 的 相 关 规 定，并 经 专 业 技 术 培 训 后，掌 握 暗 褐 脉 柄 牛 肝 菌 基 础 知 识 及 暗 褐 脉柄 牛 肝 菌 菌 种 生 产 技 术 规 程。4.2 生 产 环 境生 产 环 境 应 符 合 N Y/T 5 2 8 中 的 相 关 要 求。4.3 设 施4.3.1 主 要 设 施主 要 设 施 包 括 原 材 料 堆 场、原 材 料 库、培 养 基 配 制 室、灭 菌 室、摇 瓶 接 种 室、摇 瓶 培 养 室、发 酵 罐配 料 室、发 酵 罐 冷 却 室、发 酵 罐 接 种 室、发 酵 罐 培 养 室、栽 培 种 冷 却 室、栽 培 种 接 种 室、栽 培 种 培 养 室、化 验 室 等。4.3.2 设 施 要 求设 施 应 符 合 以 下 要 求：a)地 面 应 能 防 水、防 腐 蚀、防 渗 漏、防 滑，易 清 洗，有 适 当 的 排 水 坡 度（1.0%1.5%）和 良 好的 排 水 系 统，排 水 沟 应 是 圆 弧 式 的 明 沟；b)墙 壁 和 天 花 板 应 能 防 潮、防 霉、防 水、易 清 洗；c)门 窗 应 设 置 防 蚊 蝇 纱 网；d)入 口 处 应 设 置 洗 手、消 毒 和 干 手、风 淋 等 洁 净 设 施，并 设 置 二 次 更 衣；e)设 置 有 排 气 管 道；f)设 置 与 职 工 人 数 相 适 应 的 更 衣 室、浴 室、厕 所 和 工 作 休 息 室；g)净 化 操 作 区 域 应 符 合 G B 5 0 0 7 3 中 的 相 关 要 求；h)摇 瓶 接 种 室、摇 瓶 培 养 室、发 酵 罐 配 料 室、发 酵 罐 冷 却 室、发 酵 罐 接 种 室、发 酵 罐 培 养 室、栽 培 种 冷 却 室、栽 培 种 接 种 室、栽 培 种 培 养 室 为 万 级 无 菌 净 化 操 作 区 域；i)开 盖 接 种 重 点 区 域 局 部 达 到 无 菌 级 百 级。4.4 设 备4.4.1 生 产 设 备包 括 但 不 限 于 发 电 设 备、调 温 设 备、空 气 压 缩 机、空 气 过 滤 器、高 压 蒸 汽 灭 菌 锅、搅 拌 机、装 瓶 设备、超 净 工 作 台、恒 温 回 旋 式 振 荡 器、液 体 菌 种 发 酵 罐、接 种 设 备 等。4.4.2 检 验 设 备D B 5 3/T 1 2 2 9 2 0 2 43恒 温 培 养 箱、冰 箱、显 微 镜、磁 力 搅 拌 机、电 子 天 平、p H 计 等。4.5 器 具4.5.1 玻 璃 三 角 瓶容 量 5 0 0 m L 1 0 0 0 m L，耐 1 2 6 高 温，无 色 或 近 无 色，配 备 硅 胶 塞。4.5.2 聚 丙 烯 塑 料 瓶符 合 G B 4 8 0 6.7 的 规 定，容 量 1 4 0 0 m L 1 6 0 0 m L，可 耐 受 1 2 6，无 色 或 近 无 色，瓶 口 直 径 6 c m 9 c m，瓶 盖 应 预 留 通 气 孔，并 可 夹 垫 海 绵 片 或 无 纺 布 以 防 止 培 养 期 的 污 染。4.5.3 其 他培 养 皿、接 种 铲/针、打 孔 器、试 管、量 杯、容 量 瓶、玻 璃 漏 斗、定 量 定 性 滤 纸 等。5 工 艺 流 程工 艺 流 程 为：母 种 接 种 摇 瓶 培 养 摇 瓶 液 体 菌 种 接 种 发 酵 罐 培 养 发 酵 罐 液 体 菌 种 接 种 栽 培瓶 培 养 栽 培 种。6 母 种 制 备6.1 母 种 制 备 应 符 合 N Y/T 5 2 8 的 规 定。6.2 母 种 质 量 要 求 应 符 合 D B 5 3/T 4 9 1 中 的 规 定。6.3 母 种 培 养 基 配 方 可 参 照 附 录 A。7 摇 瓶 液 体 菌 种 制 备7.1 培 养 基 配 制 与 分 装培 养 基 配 参 见 附 录 A。用 水 符 合 G B 5 7 4 9 要 求，以 4.5.1 中 的 玻 璃 三 角 瓶 分 装 培 养 基，装 液 量 不 超 过三 角 瓶 容 量 的 6 0%。7.2 灭 菌灭 菌 温 度 1 2 1，灭 菌 时 间 3 0 m i n。灭 菌 完 毕 后，应 自 然 降 压，不 允 许 强 制 降 压。7.3 冷 却将 灭 菌 后 的 液 体 培 养 基 放 入 摇 瓶 接 种 室 内 超 净 工 作 台 中 进 行 冷 却，冷 却 至 2 0 2 5。7.4 接 种在 超 净 工 作 台 上，使 用 打 孔 器 和 接 种 铲/针，按 无 菌 操 作 要 求 接 种。每 瓶 接 2 3 块，直 径 6 m m 8 m m琼 脂 培 养 基 的 母 种 菌 块。7.5 培 养7.5.1 培 养 室 准 备D B 5 3/T 1 2 2 9 2 0 2 44培 养 室 使 用 的 前 两 天，宜 用 臭 氧 发 生 器 消 毒。恒 温 回 旋 式 振 荡 器 以 1.8 g/L 2.2 g/L 新 洁 尔 灭 或 7 5%酒 精 进 行 擦 拭 消 毒。7.5.2 培 养 方 法接 种 后，置 于 恒 温 回 旋 式 振 荡 器 培 养 6 d 7 d，振 荡 频 率 1 5 0 r/m i n 1 8 0 r/m i n，培 养 温 度 2 6 2 9 为 宜。7.6 检 查培 养 期 间 每 天 检 查，及 时 去 除 污 染 或 异 常 的 菌 种，并 应 留 样 用 于 检 验。7.7 质 量 要 求培 养 结 束 时，摇 瓶 液 体 菌 种 应 达 到 表 1 中 的 技 术 指 标 及 表 2 中 的 理 化 指 标。表 1 摇 瓶 液 体 菌 种 技 术 指 标特征 指标菌丝形态 菌丝体球状，呈淡黄 色，菌球大小均匀，形状规则，均匀悬浮分布于菌液中。菌液形态 菌液黄至黄褐色，黏 度大，澄清，静置不分层。菌液气味 有类似于暗褐脉柄牛 肝菌菇体的的芳香气味，无异味，如酸、臭味等。菌丝显微形态有大量分枝，分枝角 度小于 4 5，菌丝纤细，有锁状联合，无霉菌菌丝、酵母和细菌 菌体。表 2 摇 瓶 液 体 菌 种 理 化 指 标性质 指标终止 p H 值 3.9 4.5菌丝干重（g/L）2 3.58 发 酵 罐 液 体 菌 种 制 备8.1 投 料 前 准 备检 查 罐 上 全 部 阀 门、安 全 阀、压 力 表，要 求 完 好，工 作 正 常。对 罐 体 内、外 和 全 部 阀 门 用 流 水 进 行冲 洗，内 壁 无 任 何 培 养 料 残 余 物、清 洁 无 死 角。8.2 培 养 基 制 备参 照 附 录 A 中 的 培 养 基 配 方 进 行 配 制。用 水 应 符 合 G B 5 7 4 9 要 求。8.3 投 料 定 容8.3.1 将 原 材 料 分 别 用 水 溶 解，倒 入 或 用 泵 抽 入 发 酵 罐 中。8.3.2 加 水 定 容 至 所 需 体 积，培 养 基 投 料 量 不 超 过 罐 体 总 容 积 的 7 0%。8.3.3 清 理 加 料 口，不 应 有 残 留 的 物 料，拧 紧 上 料 口 盖。D B 5 3/T 1 2 2 9 2 0 2 458.4 发 酵 罐 实 消对 投 料 后 的 发 酵 罐 进 行 高 压 蒸 汽 灭 菌，蒸 汽 压 力 0.1 0 5 M P a 0.1 2 5 M P a，温 度 1 2 1 1 2 4，保持 2 0 m i n 4 0 m i n。8.5 冷 却、调 压8.5.1 灭 菌 结 束，将 发 酵 罐 移 至 冷 却 室，通 入 无 菌 空 气，开 启 冷 水 阀 门 采 用 水 淋 降 温，冷 却 水 通 过 下水 道 排 出。8.5.2 待 温 度 降 至 2 6，关 闭 冷 水 阀 门，调 整 排 气 口 与 无 菌 空 气 进 气 阀 门，使 罐 内 压 力 维 持 在 0.0 3 M P a。8.6 接 种按 下 列 步 骤 完 成 接 种：a)发 酵 罐 接 种 口 底 部 以 9 5%酒 精 点 燃 火 焰 圈，灼 烧 3 m i n；b)调 节 排 气 阀，使 罐 内 压 力 降 至 0.0 1 M P a；c)打 开 发 酵 罐 接 种 口 盖，在 火 焰 上 打 开 摇 瓶 液 体 菌 种，灼 烧 瓶 口 后 倒 入 发 酵 罐 中,接 种 量 为 1 6 0 0（v/v）；d)用 火 焰 灼 烧 接 种 口 盖 后 迅 速 拧 紧，移 走 火 焰 圈，调 整 罐 压 保 持 在 0.0 3 M P a。8.7 培 养接 种 完 毕，立 即 进 入 培 养 阶 段，应 满 足 下 列 条 件：a)罐 内 换 气 量 1 0.5 1.2（v v，料 液 体 积 空 气 体 积)；b)罐 压 保 持 在 0.0 2 M P a 0.0 5 M P a；c)培 养 温 度 2 6 2 9；d)机 械 搅 拌 式 发 酵 罐 所 使 用 的 磁 力 搅 拌 频 率 为 2 0 H z；e)培 养 4 d 6 d 时，观 测 其 培 养 状 况，达 到 表 3 中 的 技 术 指 标，及 表 4 中 的 理 化 指 标，即 可 终止。表 3 发 酵 罐 液 体 菌 种 技 术 指 标特征 指标菌球形态菌丝体球状或絮 状，淡黄色，菌丝球悬浮，菌丝球细小，菌丝束多可见，均匀分布 于菌液中菌液形态 菌液淡黄至黄褐 色，透明澄清，静置不分层。菌液气味 有类似于暗褐脉 柄牛肝菌菇体的 的芳香气味，无异味，如酸、臭味等。菌丝显微形态有大量分枝，分 枝角度小于 4 5，菌丝纤细，有锁状联合，菌丝内原生质分布均匀，无霉菌菌丝、酵母 和细菌菌体。表 4 发 酵 罐 液 体 菌 种 理 化 指 标特征 指标终止 p H 值 4.2 4.6菌丝干重（g/L）1.5 3.0D B 5 3/T 1 2 2 9 2 0 2 469 栽 培 种 制 备9.1 培 养 基 制 备参 照 附 录 A 中 的 培 养 基 配 方 进 行 配 制，用 水 应 符 合 G B 5 7 4 9 要 求。9.2 装 瓶以 4.5.2 中 的 聚 丙 烯 塑 料 瓶 分 装 培 养 基，装 瓶 量 为 每 瓶 湿 重 1 0 0 0 g 1 0 8 0 g，料 面 距 瓶 口 2 c m 3 c m，中 间 打 4 个 孔。9.3 灭 菌灭 菌 温 度 1 2 3，灭 菌 时 间 1 0 0 m i n。灭 菌 完 毕 后，应 自 然 降 压。9.4 冷 却灭 菌 后 的 菌 种 瓶 放 入 冷 却 室 冷 却 至 1 6 2 0。9.5 接 种在 无 菌 级 百 级 区 域 内，使 用 无 菌 管 道 在 0.1 5 M P a 压 力 下，将 发 酵 罐 液 体 菌 种 注 射 接 种 到 菌 种 瓶 中，每 瓶 接 入 液 体 菌 种 2 5 m l 3 0 m l。接 种 完 成 后，应 写 明 接 种 日 期、批 次，送 入 培 养 室。9.6 培 养避 光 培 养。温 度 2 6 2 9，C O2浓 度 控 制 在 1 5 0 0 p p m 2 0 0 0 p p m、相 对 空 气 湿 度 6 0%7 0%，培 养2 8 d 3 0 d，菌 丝 长 满。9.7 检 查在 培 养 期 间，每 天 抽 样 开 盖 观 察 菌 种 萌 发、生 长 情 况，并 由 菌 瓶 外 壁 观 察 菌 丝 生 长 情 况，对 生 长 异常 的 菌 瓶 开 盖 检 查，及 时 去 除 污 染 或 异 常 的 菌 种，并 应 及 时 留 样 用 于 检 验。9.8 质 量 要 求应 符 合 D B 5 3/T 4 9 1 的 规 定。1 0 记 录 与 档 案生 产 各 个 环 节 应 填 写 生 产 记 录，生 产 记 录 表 参 见 附 录 B。由 具 体 操 作 人 员 现 场 记 录 填 写，由 技 术 负责 人 审 核，签 字 后 归 档，档 案 保 存 至 少 2 年。1 1 标 签、标 志、包 装、运 输、贮 存标 签、标 志、包 装、运 输、贮 存 应 符 合 D B 5 3/T 4 9 1 的 规 定。D B 5 3/T 1 2 2 9 2 0 2 47A A附 录 A（资 料 性）暗 褐 脉 柄 牛 肝 菌 菌 种 生 产 培 养 基 配 方A.1 母 种 培 养 基 配 方蔗 糖 2 0 g、磷 酸 二 氢 钾 0.5 g、硫 酸 镁 1 g、马 铃 薯 2 0 0 g（切 片 煮 汁）、琼 脂 粉 1 0 g 1 5 g、定 容 至 1L，p H 值 自 然。A.2 摇 瓶 液 体 菌 种 培 养 基 配 方A.2.1 马 铃 薯 2 0 0 g（切 片 煮 汁）、酵 母 膏 2 g、葡 萄 糖 2 0 g，定 容 至 1 L，p H 值 自 然。A.2.2 蔗 糖 2 0 g、磷 酸 二 氢 钾 0.5 g、硫 酸 镁 1 g、马 铃 薯 2 0 0 g（切 片 煮 汁）、豆 粕 粉（过 1 0 0 目 筛，筛 孔直 径 0.1 5 m m）2 g、定 容 至 1 L，p H 值 自 然。A.2.3 马 铃 薯 2 0 0 g（切 片 煮 汁）、麦 麸 2 g、蔗 糖 2 0 g、硫 酸 亚 铁 1 g、定 容 至 1 L，p H 值 自 然。A.3 发 酵 罐 液 体 菌 种 培 养 基 配 方A.3.1 马 铃 薯 淀 粉 1.5 g/L、糖 蜜 2 g/L、硫 酸 镁 0.5 g/L、酵 母 膏 2 g/L、氯 化 钾 1 g/L、消 泡 剂 0.2 5 g/L，p H 值 4 6。A.3.2 马 铃 薯 1 0 0 g/L（切 片 煮 汁）、蔗 糖 1.5 g/L、麦 麸 2 g/L、维 生 素 C 为 5 0 m g/L、硫 酸 镁 1 g/L、磷 酸二 氢 钾 1 g/L、消 泡 剂 0.2 5 g/L，p H 值 4 6。A.4 栽 培 种 培 养 基 配 方A.4.1 按 质 量 占 比 木 屑 2 0%、谷 粒 4%、蔗 渣 8%、红 壤 土 8%、硫 酸 镁 0.0 4%、磷 酸 二 氢 钾 0.0 4%、酵 母 膏 0.0 4%、含 水 量 6 0%，p H 值 自 然。A.4.2 按 质 量 占 比 木 屑 2 0%，麦 粒 4%，玉 米 秸 秆 8%，红 壤 土 8%，硫 酸 镁 0.0 4%，磷 酸 二 氢 钾 0.0 4%；酵 母膏 0.0 8%、含 水 量 6 0%，p H 值 自 然。D B 5 3/T 1 2 2 9 2 0 2 48B B附 录 B（资 料 性）暗 褐 脉 柄 牛 肝 菌 菌 种 生 产 记 录 表暗 褐 脉 柄 牛 肝 菌 菌 种 生 产 记 录 表 见 表 B.1。表 B.1 暗 褐 脉 柄 牛 肝 菌 菌 种 生 产 记 录 表菌 种 批 次 编 号：菌 种 编 号：接种日期 培养基 接种数量 接种人母种摇瓶液体菌种发酵罐液体菌种栽培种技 术 负 责 人 审 核：DB53/T 1229 2024