牛场气溶胶结核分枝杆菌复合群荧光定量PCR检测技术规程DB37／T 3624-2019.pdf

ICS 11.220 B 41 DB37 山东省 地 方 标 准 DB 37/T 3624 2019 牛场气溶 胶结核分 枝杆菌复 合群荧光 定量PCR 检测技术规程 Detection of Mycobacterium tuberculosis complex pathogenic organisms in aerosol of cattle farm by Real-time PCR 2019-07-23 发布 2019-08-23 实施 山 东 省 市 场 监 督 管 理 局 发布 DB37/T 3624 2019 I 目 次 前言.II 1 范围.1 2 规范 性引 用文 件.1 3 术语 和定 义.1 4 缩略 语.1 5 原理.1 6 材料 及设 备.1 6.1 试剂.2 6.2 仪 器设 备.2 7 生物 安全 措施.2 8 气溶 胶样 品的 采集、保 存及运 输.2 8.1 气 溶胶 样品 的采 集.2 8.2 气 溶胶 样品 的采 集后 的灭活 处理.2 8.3 样 品的 保存 和运 输.2 9 操作 方法.2 9.1 气 溶胶 样本 的前 处理.2 9.2 核 酸提 取.3 9.3 荧 光定 量PCR 检测.3 10 分 析条 件设 定和 结果 判 定.3 10.1 阈值 设定.3 10.2 质控.3 10.3 结果 分析 及判 定.3 11 注 意事 项.3 附 录 A（资 料性 附录）主 要仪 器设 备.4 附 录 B（规 范性 附录）牛 场环 境气 溶胶 样本 的 采集方 法和 注意 事项.5 附 录 C（资 料性 附录）气 溶胶 结核 分枝 杆菌 复 合群核 酸荧 光定 量PCR 检 测结果 图.7 附 录 D（规 范性 附录）检 测过 程防 止交 叉污 染 的措施.9 DB37/T 3624 2019 II 前 言 本标准 按照GB/T 1.1 2009 给出 的规 则起 草。本标准 由山 东省 畜牧 兽医 局提出 并监 督实 施。本标准 由山 东省 畜牧 业专 业标准 化技 术委 员会 归口。本标准 起草 单位：山 东省 农业科 学院 奶牛 研究 中心、山东 师范 大学。本标准 主要 起草 人：王洪 梅、何 洪彬、赵 贵民、侯 佩莉、潘伟、何 成强、于 志君。DB37/T 3624 2019 1 牛 场气溶 胶结核分 枝杆菌 复合群荧 光定 量 PCR 检测 技术规 程 1 范围 本标准 规定了 牛场 环境气 溶胶样 本中结 核分 枝杆菌 复合群 核酸实 时荧 光定量PCR 检测 方法的 技术 要求和操 作规 范。本标准 适用 于牛 场环 境中 气溶胶 结核 分枝 杆菌 复合 群核酸 的快 速准 确检 测。2 规范性 引用 文件 下列文 件对 于本 文件 的应 用是必 不可 少的。凡 是注 日期的 引用 文件，仅 所注 日期的 版本 适用 于 本 文件。凡 是不 注日 期的 引用 文件，其最 新版 本（包括 所有的 修改 单）适用 于本 文件。GB/T 6682 分 析实 验室 用 水规格 和试 验方 法 GB 19489 实验 室生 物安 全通用 要求 3 术语和 定义 下列术 语和 定义 适用 于本 文件。3.1 Ct 值 Cycle Threshold 荧光信 号量 达到 设定 的阈 值时所 经历 的循 环数。4 缩略语 下列缩 略语 适用 于本 文件。MTC：结核 分枝 杆菌 复合 群，包括 结核 分枝 杆菌（M.tuberculosis）、牛 分枝 杆 菌（M.bovis）、非洲分枝 杆菌（M.africanum）、坎 纳分 支杆 菌（M.canettii）等（Mycobacterium tuberculosis complex）AGI：全玻 璃液 体冲 击式 采 样器（All-Glass-Impinger）5 原理 本标准 采用SYBR Green I 染料实 时荧 光定 量PCR技术。MTC 细 菌的 分泌 性蛋 白MBP70 基因 非常 保守，因 此以 它 为目的 基因 设计 引物，可 以对结 核病 病原 进行检测。6 材料及 设备 DB37/T 3624 2019 2 6.1 试剂 6.1.1 试剂级 别 检测中 使用 的试 剂均 为分 析纯，实验 室用 水应 符合GB/T 6682 的 要求。6.1.2 引物序 列 上游引 物（MTC-F）：5-TGACCAGCATCCTGACCTACC-3。下游引 物（MTC-R）：5-CGGCGTTACCGACCTTGA-3。引物在 使用 时用 灭菌 双蒸 水稀释 成10 mol/L 工作 液，置 于-20 保存。6.1.3 主要组 分 SYBR Green I 荧 光定 量PCR 反应缓 冲液，采 用商 品化 试剂。6.1.4 对照设 置 阳性对 照为 灭活BCG 疫苗 菌 株提取 的基 因组DNA，-20 保存 备用。阴 性对 照为 采集自 无结 核病 病原污染的 净化 健康 牛场 气溶 胶样本 提取 的基 因组DNA。6.2 仪器设 备 仪器设 备及 参数 见附 录A。7 生物安 全措 施 为了保 护实 验室 人员 的安 全，应 由具 备资 格的 工作 人员检 测结 核分 枝杆 菌复 合群核 酸，所有 检 测 样本应在 级 生物 安全 柜内 操作。8 气溶胶 样品 的采 集、保存 及运输 8.1 气溶胶 样品 的采 集 应用空 气微 生物 采样 箱，使用国 际标 准的AGI 采集 样 本。采 集方 法和 注意 事项 见附录B。8.2 气溶胶 样品 的采 集后 的灭 活处理 样品采 集后 立即 用70%乙 醇 溶液灭 活处 理。8.3 样品的 保存 和运 输 待检样 品在2 8 保 存不应 超过24 h；-20 保 存不超 过三 个月；-80 以下可 长期 保存。样品应置 于低 温（2 8）、密封 的容 器内 运输。9 操作方 法 9.1 气溶胶 样本 的前 处理 取30 mL 采 集的 气溶 胶样 本，12 000 r/min 离心10 min，弃上 清，重悬 沉淀 物，继续进 行核 酸提 取，或置-20 备用。DB37/T 3624 2019 3 9.2 核酸提取 采用商 品化 细菌 基因 组DNA 提取试 剂盒 进行 核酸 提取。9.3 荧光定 量PCR 检测 9.3.1 反应液 的配 制 采用20 L 反应 体系，每 个反应 管包 含荧 光定 量PCR 反应液（2）：10.0 L，上、下游 引物 各0.8 L，检 测模 板或 阴阳 性对 照2 L，灭 菌蒸 馏水6.4 L。需 要配 制的 荧光 定量PCR反 应液 管数 为样 品个数n+2（阳 性对 照）+2（阴 性对照）+2（防 止分 装时 液体损 失）。按 照顺 序依 次加入 上述 各荧 光定 量PCR反应组 份的 预混 液，然后 在每个PCR 反应 管中 分装18 L。9.3.2 加样 在已分 装有荧 光PCR 预混 液 的PCR 光 学管 中每 管 分别 加 入2 L 待检 样品或 对照 模 板，混 匀，盖 上管盖，放 入荧 光PCR 仪，记 录 样品放 置顺 序。9.3.3 荧光定 量PCR 扩增 选择检 测模式：SYBR Green I。反 应体 系：20 L。反应条 件设定：预 变性：95 30 s，1 个循环；PCR 扩 增：95 5 s，61 30 s，40 个 循环，6 1 时 采集 荧光 信号。熔解：95 15 s，65 1 min，95，Continuous；40 10s。可根 据不 同品牌PCR 仪器 说明 书等 效 设置参 数。10 分析条 件设 定和 结果 判定 10.1 阈值设 定 综合分 析仪 器给 出的 各 项 结果，基 线（Baseline）以 仪器给 出的 默认 值作 为参 考，阈值（Threshold）设定原 则以 阈值 线刚 好超 过阴性 对照 样品 扩增 曲线 的最高 点为 准，具体 需根 据仪器 噪声 情况 进行 调 整，选择PCR 扩 增反 应所 设定 的 荧光基 团对 应的 通道 进行 分析。10.2 质控 质控有 效的条 件为：阴性 对照和 空白对 照应 无Ct 值 或35，阳性 对照 的Ct值 应35，且呈 现S 型扩增曲线。10.3 结果分 析及 判定 结核分 枝杆 菌复 合群 核酸 阴性反 应结 果判 定：检 测 结果呈 现无Ct值、无扩 增 曲线、扩 增反 应曲 线无明显对 数增 长期，判 为荧 光定量PCR 阴性 反应，样 品 判定为 结核 分枝 杆菌 复合 群核酸 检测 阴性。结核分 枝杆 菌复 合群 核酸 阳性反 应结 果判 定：检测 结果呈 现Ct 值35、扩增 曲线有 明显 的对 数 增 长期，且 熔解 曲线Tm 值 为（92.5 0.5），判为 荧光 定量PCR 结 果阳 性反 应，样 品判为 结核 分枝 杆菌 复合群核酸 检测 阳性。见 附录C。11 注意事 项 注意的 事项 见附 录D。DB37/T 3624 2019 4 A A 附 录 A（资料 性附 录）主要仪 器设 备 A.1 荧光 定量PCR 仪（全 波长）。A.2 台式 离心 机（转子 容 积2 mL，50 mL；最 高离 心 力15 000 g）。A.3 电热 恒温 水槽（室 温 至100）。A.4 涡旋 振荡 器。A.5 天平（精 密度 千分 之 一以上）。A.6 冰箱（2 8，-20，-80）。A.7 微量 可调 移液 器（0.25 L，10 L，100 L，200 L，1 000 L）。A.8 微量 带滤 芯吸 头（10 L，100 L，1 000 L）。A.9 级 生物 安全 柜A型。A.10 1.5 mL Eppendorf 管。A.11 0.2 mL 8 联排PCR 反 应管。A.12 一次 性手 套。A.13 一次 性口 罩。A.14 医用 废弃 物容 器。DB37/T 3624 2019 5 B B 附 录 B（规范 性附 录）牛场环 境气 溶胶 样本 的采 集方法 和注 意事项 B.1 采样环 境 环境温 度5。B.2 试剂 0.9%灭菌 生理 盐水 和橄 榄 油。B.3 仪器与 耗材 空气微 生物采 样箱，Porton 空气微 生物 采样器，三 角 支架，灭菌注 射器（10 mL），一 次性口 罩，一次性 手套，一 次性 无菌 隔离服。B.4 采样人 员要 求 现场采 样的 工作 人员 要穿 工作服 和胶 鞋、戴 上口 罩、防风眼 镜和 一次 性乳 胶手 套，做好 个人 安全 防护。B.5 采样工 具 采集气 溶胶 用的 气溶 胶采 样器、生 理盐 水分 别包 装 并提前121 高 压灭 菌消 毒，灭菌 的离 心管，灭菌的塑 料袋，一 次性 注射 器，胶 布，保 温箱，记 号 笔。使 用前 要仔 细检 查塑 料管、消毒 的塑 料袋，有 破损者不 得使 用。B.6 气溶胶 样品 采样 B.6.1 设备安 装：首 先安 装三 脚 架，空 气微生 物采 样器 放 置高度 为距地 面1.5 m，将30 mL 灭 菌生理 盐水注入，同时 滴加 一滴 橄 榄油，放 入三 脚固 定支 架 内固定。橡胶 连接 管的 一 端接到 空气 微生 物采 样箱 主机入气 口上，另 一端 连接 到Porton 空 气微 生物 采样 器的出 气口 上。B.6.2 收集参 数：采用 液体 冲击 式采样 方式，采 样流 量为12.5 L/min，采 样时 间为30 min。B.6.3 收集标 准：每个 牛场 一般 在产房、动 物房、运 动场 和奶厅4个 位置 分别 采集2 份样本。B.6.4 样品的 灭活 处理 与分 装：气溶胶 采样 器采 集结 束后，直接 将30 mL 样本 收集 到 采集50 mL 离心 管，采样器 立即 用70%乙 醇溶 液灭活 处理，放 入塑 料袋 封口。气溶 胶采 集液 立即 用70%乙醇 溶液 灭活 处 理，盖好离 心管 盖，胶布 封口，在塑料 管壁 记录 采样 牛场、位置、采 样时 间、采样 人，然后 装入 塑料 袋封 口，在塑料 袋上 同样 记录 采样 牛场、位置、采 样时 间、采 样人。将装 有气 溶胶 样本 的塑料 管竖 直口 朝上 和 冰袋一块 放入 保温 箱，盖 好 盖子，胶 带封 口。派 车专 程 送往有 条件 的实 验室 进行 结核分 枝杆 菌复 合群 荧光定量PCR 检 测，采集 的两 份 样品，一份 用于 直接 检测，另一 份-20 保存 用于 复检。DB37/T 3624 2019 6 B.6.5 样品运 送：在 样品 运送过 程中，装样品 的保 温箱不 得倾倒，以防 液体 外溢。到达目 的地后，对车体应 全面 消毒。B.7 采样现 场用 具处 理 现场采 集完 气溶 胶，立即 对空气 微生 物采 样箱、三 角支架 用70%乙 醇溶 液消 毒。DB37/T 3624 2019 7 C C 附 录 C（资料 性附 录）气溶胶 结核 分枝 杆菌 复合 群核酸 荧光 定 量 PCR 检测 结果图 说明：1 7 代表5 1065 100拷贝数/反应的标准品的扩增曲线，曲线8 为阴性对照。图C.1 结核分 枝杆 菌复 合群 荧光 定量 PCR 灵 敏度 扩增 曲线 说明：1 和2 的模 板 分 别为 牛 结核 分 枝杆 菌 和 结核 分 枝 杆菌 核 酸，均为S 型曲 线；3-10 分 别为：禽 分枝 杆 菌、副 结 核分枝杆菌、金 黄色葡萄球菌、沙 门氏杆菌、溶血性链球菌、嗜 肺巴氏杆菌、螺旋杆菌、绿脓 杆菌的核酸，均为 一条直线，扩增反应为阴性；曲线11为阴性对照。图C.2 结核分 枝杆 菌复 合群 荧光 定量 PCR 特 异性 扩增 曲线 DB37/T 3624 2019 8 说明：结核分枝杆菌复合群核酸阳性的熔解曲线Tm 值为：（92.5 0.5）。图C.3 结核分 枝杆 菌复 合群 核酸 阳性结 果熔 解曲 线 DB37/T 3624 2019 9 D D 附 录 D（规范 性附 录）检测过 程防 止交 叉污 染的 措施 D.1 样品采 集与 运输 D.1.1 采样采 集 采集样 本使 用独 立的 气溶 胶采样 器和 收集 管。一个 气溶胶 采样 器限 于采 集一 份样本，收 集管 使 用 一次性灭 菌离 心管。防 止不 同样品 之 间 通过 采样 器、收集管 交叉 污染。D.1.2 样本运 输与 贮存 防止样 品在 运输 与贮 存过 程中包 装损 坏造 成交 叉污 染。D.2 检测过 程 PCR 反 应试 剂应 按检 测需 求 分装贮 存，避 免同 一管 试 剂多次 开启 使用。装有 核 酸模板、PCR 试剂 和引物的离 心管 在打 开之 前，应短暂 离心，所 有操 作尽 量避免 产生 气溶 胶。上机 运行前，应 检查 并盖 紧各PCR管。D.3 人员要 求 采样人 员穿 一次 性无 菌隔 离服，戴一 次性 手套 和口 罩。实 验室 检测 人员 应由 具备资 格的 工作 人 员 操作。D.4 用具灭 菌 气溶胶 采样 器清 洗干 净后121 高压 灭菌 处理20 min。D.5 仪器设 备与 耗材 使用带 滤芯 吸头。吸 头、离 心管、PCR 管 等应 一次 性 使用，不得 回收 清洗 后重 复使用。D.6 实验室 实验室 应该 设有 核酸 提取 工作区、PCR 加 样工 作区 以 及荧光 定量PCR 仪放 置区，不同区 域可 密闭 进行紫外消 毒，并 配备 级生 物安全 柜A型。上述 区域 在 每次使 用后应 及时 清洁处 理，并 在使用 前后 照射 紫外30 min 以 上。每个 区域 应有专 门的 废弃 物容 器，该容器 应能 耐受 煮沸、70%乙醇 溶液 消毒 处理。每 次实验结 束，应在 紫外 消毒 前，及时 清理 废弃 物及 消毒 容 器，并 将该 废弃 物容 器放 回 工作区 进行 紫外 消毒。D.7 其他 DB37/T 3624 2019 10 应遵循 核酸 检测 实验 室其 他技术 要求。_