牛羊养殖场气溶胶布鲁氏菌荧光定量PCR鉴别检测技术规程DB37／T 3625-2019.pdf

ICS 11.220 B 41 DB37 山东省 地 方 标 准 DB 37/T 3625 2019 牛羊养殖 场气溶胶 布鲁氏菌 荧光定量PCR鉴别检测 技术规程 Differential detection of Brucella pathogenic organisms in aerosol of cattle and sheep farm by Real-time PCR 2019-07-23 发布 2019-08-23 实施 山 东 省 市 场 监 督 管 理 局 发布 DB37/T 3625 2019 I 目 次 前言.II 1 范围.1 2 规范 性引 用文 件.1 3 术语 与定 义.1 4 缩略 语.1 5 原理.1 6 材料 及设 备.1 6.1 试剂.1 6.2 仪 器设 备.2 7 生物 安全 措施.2 8 气溶 胶样 品的 采集、保 存及运 输.2 8.1 气 溶胶 样品 的采 集.2 8.2 气 溶胶 样品 的采 集后 的灭活 处理.2 8.3 样 品的 保存 和运 输.2 9 操作 方法.2 9.1 气 溶胶 样本 的前 处理.2 9.2 核 酸提 取.3 9.3 荧 光定 量PCR 检测.3 10 分 析条 件设 定和 结果 判 定.3 10.1 阈值 设定.3 10.2 质控.3 10.3 结果 分析 及判 定.3 11 注 意事 项.4 附 录 A（资 料性 附录）主 要仪 器设 备.5 附 录 B（规 范性 附录）牛 羊养 殖场 环境 气溶 胶 样本的 采集 方法 和注 意事 项.6 附 录 C（资 料性 附录）气 溶胶 布鲁 氏菌 核酸 荧 光定 量PCR 鉴别 诊断 结果 图.8 附 录 D（规 范性 附录）检 测过 程防 止交 叉污 染 的措施.11 DB37/T 3625 2019 II 前 言 本标准 按照GB/T 1.1 2009 给出 的规 则起 草。本标准 由山 东省 畜牧 兽医 局提出 并监 督实 施。本标准 由山 东省 畜牧 业专 业标准 化技 术委 员会 归口。本标准 起草 单位：山 东省 农业科 学院 奶牛 研究 中心、山东 师范 大学。本标准 主要 起草 人：何 洪 彬、赵贵 民、王 洪梅、侯 佩 莉、马文 青、何 成强、程 凯 慧、杨宏 军、张 亮、解晓莉。DB37/T 3625 2019 1 牛 羊养殖 场气溶胶 布鲁氏 菌荧光定 量 PCR 鉴别检测 技术规 程 1 范围 本标准 规定 了牛 羊养 殖场 环境气 溶胶 样本 中布 鲁氏 菌核酸 荧光 定量PCR 鉴别 诊 断方法。本标准 适用 牛羊 养殖 场环 境中气 溶胶 布鲁 氏菌 核酸 的检测 以及 牛种、羊 种和 猪 种布鲁 氏菌 核酸 的 鉴别检测。2 规范性 引用 文件 下列文 件对 于本 文件 的应 用是必 不可 少的。凡 是注 日期的 引用 文件，仅 所注 日期的 版本 适用 于 本 文件。凡 是不 注日 期的 引用 文件，其最 新版 本（包括 所 有的 修改 单）适用 于本 文件。GB/T 6682 分 析实 验室 用 水规格 和试 验方 法 GB 19489 实验 室生 物安 全通用 要求 3 术语与 定义 下列术 语和 定义 适用 于本 文件。3.1 Ct 值 Cycle Threshold 荧光信 号量 达到 设定 的阈 值时所 经历 的循 环数。4 缩略语 下列缩 略语 适用 于本 文件。AGI：全玻 璃液 体冲 击式 采 样器（All-Glass-Impinger）5 原理 本标准 采用SYBR Green I 染料实 时荧 光定 量PCR技术。布鲁氏 菌IS711（Insertion Sequence 711，IS711）插入序 列在 不同 种的 布鲁 氏菌基 因组 中高 度保守，仅在 拷贝 数上 存在 差 异。一条 引物 锚定 在IS711 上，另一 条引 物分 别选 在 不同种 布鲁 氏菌IS711插入序列邻 近的 上下 游单 染色 体DNA 上，可以 用来 鉴别 布 鲁氏菌 种的 特异 性。6 材料及 设备 6.1 试剂 6.1.1 试剂级 别 DB37/T 3625 2019 2 检测中 使用 的试 剂均 为分 析纯，实验 室用 水应 符合GB/T 6682 的 要求。6.1.2 引物序 列 通用型 上游 引物（Brucella-F）：5-TCTTTGTCGTGGGCTTCATCG-3。通用型 下游 引物（Brucella-R）：5-TGGTCTGCACCATCGTCTTGTC-3。牛种上 游引 物（Abortus-F）：5-ACCATTGAAGTCTGGCGAGCA-3。羊种上 游引 物（Melitensis-F）：5-TCGCTGTCACTGTTGCAAGTATG-3。猪种上 游引 物（Suis-F）：5-AAAGGGAGTGGGTTCTAGGGCG-3。牛、羊 和猪 种下 游共 用IS711-R：5-GACCGCATTCATGGGTTTCG-3。引物在 使用 时用 灭菌 双蒸 水稀释 成10 mol/L 工作 液，置 于-20 保存。6.1.3 主要组 分 SYBR Green I 荧 光定 量PCR 反应缓 冲液，采 用商 品化 试剂。6.1.4 对照设 置 阳性对 照均 为疫 苗株 灭活 后提取 的核 酸样 本，有牛 种布鲁 氏菌A19 疫苗 株基 因 组DNA、羊 种布 鲁氏 菌M5疫苗 株基 因组DNA 和猪 种 布 鲁氏 菌S2 疫苗 株基 因组DNA，-20 保存 备用。阴 性 对照为 采集 自无 布鲁 氏菌污染 的净 化健 康牛 场气 溶胶样 本提 取的 基因 组DNA。6.2 仪器设 备 仪器设 备及 参数 见附 录A。7 生物安 全措 施 为了保 护实 验室 人员 的安 全，应 由具 备资 格的 工作 人员检 测布 鲁氏 菌核 酸，所有检 测样 本应 严 格 在级生 物安 全柜 内操 作。8 气溶胶 样品 的采 集、保存 及运输 8.1 气溶胶 样品 的采 集 应用空 气微 生物 采样 箱，使用国 际标 准的AGI 采集 样 本。采 集方 法与 注意 事项 见附录B。8.2 气溶胶 样品 的采 集后 的灭 活处理 样品采 集后 立即 用2%石碳 酸溶液 灭活 处理。8.3 样品的 保存 和运 输 待检样 品在2 8 保 存不应 超过24 h；-20 保 存不超 过三 个月；-80 以下可 长期 保存。样品应置 于低 温（2 8）、密封 的容 器内 运输。9 操作方 法 9.1 气溶胶 样本 的前 处理 DB37/T 3625 2019 3 取30 mL 采 集的 气溶 胶样 本，12 000 r/min 离心10 min，弃上 清，重悬 沉淀 物，继续进 行核 酸提 取，或置-20 备用。9.2 核酸提 取 采用商 品化 细菌 基因 组DNA 提取试 剂 盒 进行 核酸 提取。9.3 荧光定 量PCR 检测 9.3.1 反应液 的配 制 采用20 L 反应 体系，每 个反应 管包 含荧 光定 量PCR 反应液（2）：10.0 L，上、下游 引物 各0.8 L，灭菌 蒸馏 水6.4 L，检测 模板 与阴、阳 性对 照分别 为2 L。需 要配 制 的荧光 定量PCR 反应 液管 数为样品 个数n+2（阳性 对照）+2（阴 性对 照）+2（防 止分装 时液 体损 失）。按 照顺序 依次 加入 上述 各荧光定量PCR 反应 组份 的预 混 液，然 后在 每个PCR 反应 管 中分装18 L。9.3.2 加样 在已分 装有荧 光PCR 预混 液 的PCR 反 应管 中每管 分别 加 入2 L 待测 样品或 对照 模 板，混 匀，盖 上管盖，放 入荧 光PCR 仪，记 录 样品放 置顺 序。9.3.3 荧光定 量PCR 扩增 选择检 测模式：SYBR Green I。反 应体 系：20 L。反应条 件设定：预 变性：95 30 s，1 个循环；PCR 扩增：95 5 s，61 30 s，40 个循环，61 时采 集荧光 信号。熔解曲 线：95 15 s，65 1 min，95，Continuous；40 10s。可 根据不 同品 牌PCR 仪 器说 明 书等效 设置 参数。10 分析条 件设 定和 结果 判定 10.1 阈值设 定 综合分 析仪 器给 出的 各项 结果，基 线（Baseline）以 仪器给 出的 默认 值作 为参 考，阈值（Threshold）设定原 则以 阈值 线刚 好超 过阴性 对照 样品 扩增 曲线 的最高 点为 准，具体 需根 据仪器 噪声 情况 进行 调 整，选择PCR 扩 增反 应所 设定 的 荧光基 团对 应的 通道 进行 分析。10.2 质控 质控有 效的条 件为：阴性 对照和 空白对 照应 无Ct 值 或35，阳性 对照 的Ct值 应35，且呈 现S 型扩增曲线。10.3 结果分 析及 判定 布鲁氏 菌核 酸阴 性反 应结 果判定：检测 结果 呈现 无Ct 值、无 扩增 曲线、扩 增反 应曲线 无明 显对 数 增长期，判为 荧光 定量PCR 阴 性反应，样 品判 定为 布鲁 氏菌核 酸检 测阴 性。布鲁氏 菌核 酸阳 性反 应结 果判定：检测 结果 呈现Ct 值35、扩增 曲线 有明 显 的对数 增长 期，且 熔解曲线的Tm值 为（84.6 0.5）：判定 为荧 光定 量PCR 结果阳 性反 应，样品 判为 布鲁氏 菌核 酸检 测阳 性。牛种布 鲁氏 菌核 酸阳 性反 应结果 判定：牛 种布 鲁氏 菌检测 结果 呈现Ct值35、且扩 增曲 线有 明 显 的对数增 长期，同 时Tm 值为：（87.8 0.5）。见 附 录C。羊种布 鲁氏 菌核 酸阳 性反 应结果 判定：羊 种布 鲁氏 菌检测 结果 呈现Ct值35、且扩 增曲 线有 明 显 的对数增 长期，同 时Tm 值为：（86.7 0.5）。见 附 录C。DB37/T 3625 2019 4 猪种布 鲁氏 菌核 酸阳 性反 应结果 判定：猪 种布 鲁 氏 菌检测 结果 呈现Ct值35、且扩 增曲 线有 明 显 的对数增 长期，同 时Tm 值为：（84.5 0.5）。见 附 录C。11 注意事 项 注意的 事项 见附 录D。DB37/T 3625 2019 5 A A 附 录 A（资料 性附 录）主要仪 器设 备 A.1 荧光 定量PCR 仪（全 波长）。A.2 台式 离心 机（转子 容 积2 mL，50 mL；最 高离 心 力15 000 g）。A.3 电热 恒温 水槽（室 温 至100）。A.4 涡旋 振荡 器。A.5 天平（精 密度 千分 之 一以上）。A.6 冰箱（2 8，-20，-80）。A.7 微量 可调 移液 器（0.25 L，10 L，100 L，200 L，1 000 L）。A.8 微量 带滤 芯吸 头（10 L，100 L，1 000 L）。A.9 级 生物 安全 柜A型。A.10 1.5 mL Eppendorf 管。A.11 0.2 mL 8 联排PCR 反 应管。A.12 一次 性手 套。A.13 一次 性口 罩。A.14 医用 废弃 物容 器。DB37/T 3625 2019 6 B B 附 录 B（规范 性附 录）牛羊养 殖场 环境 气溶 胶样 本的采 集方 法和 注意 事项 B.1 采样环 境 环境温 度5。B.2 试剂 0.9%灭菌 生理 盐水 和橄 榄 油。B.3 仪器与 耗材 空气微 生物采 样箱，Porton 空气微 生物 采样器，三 角 支架，灭菌注 射器（10 mL），一 次性口 罩，一次性 手套，一 次性 无菌 隔离服。B.4 采样人 员要 求 现场采 样的 工作 人员 要穿 工作服 和胶 鞋、戴 上口 罩、防风眼 镜和 一次 性乳 胶手 套，做好 个人 安全 防护。B.5 采样工 具 采集气 溶胶 用的 气溶 胶采 样器、生 理盐 水分 别包 装 并提前121 高 压灭 菌消 毒，灭菌 的离 心管，灭菌的塑 料袋，一 次性 注射 器，胶 布，保 温箱，记 号 笔。使 用前 要仔 细检 查塑 料管、消毒 的塑 料袋，有 破损者不 得使 用。B.6 气溶胶 样品 采样 B.6.1 设备安 装：首 先安 装三 脚 架，空 气微生 物采 样器 放 置高度 为距地 面1.5 m，将30 mL灭 菌生理 盐水注入，同时 滴加 一滴 橄 榄油，放 入三 脚固 定支 架 内固定。橡胶 连接 管的 一 端接到 空气 微生 物采 样箱 主机入气 口上，另 一端 连接 到Porton 空 气微 生物 采样 器的出 气口 上。B.6.2 收集参 数：采用 液体 冲击 式采样 方式，采 样流 量为12.5 L/min，采 样时 间为30 min。B.6.3 收集标 准：每个 牛羊 养殖 场一般 在产 房、动物 房、运动场 和奶 厅4 个位 置分 别 采集2 份样 本。B.6.4 样品的 灭活 处理 与分 装：气溶胶 采样 器采 集结 束后，直接 将30 mL 样本 收集 到 采集50 mL 离心 管，采样器 立即 用2%石 碳酸 溶 液灭活 处理，放 入塑 料袋 封 口。气 溶胶 采集 液立 即用2%石碳 酸溶 液灭 活处 理，盖好离 心管 盖，胶布 封口，在塑料 管壁 记录 采样 牛场、位置、采 样时 间、采样 人，然后 装入 塑料 袋封 口，在塑料 袋上 同样 记录 采样 牛场、位置、采 样时 间、采 样人。将装 有气 溶胶 样本 的塑料 管竖 直口 朝上 和 冰袋一块 放入保 温箱，盖 好 盖子，胶带封 口。派车 专 程送往 有条件 的实 验室 进 行布鲁 氏菌荧 光定 量PCR 鉴别检测，采 集的 两份 样品，一份 用于 直接 检测，另 一份-20 保存 用于 复检。DB37/T 3625 2019 7 B.6.5 样品运 送：在 样品 运送过 程中，装样品 的保 温箱不 得倾倒，以防 液体 外溢。到达目 的地后，对车体应 全面 消毒。B.7 采样现 场用 具处 理 现场采 集完 气溶 胶，立 即 对空气 微生 物采 样箱、三 角支架 用1%来 苏尔 溶液 消 毒。DB37/T 3625 2019 8 C C 附 录 C（资料 性附 录）气溶胶 布鲁 氏菌 核酸 荧光 定量 PCR 鉴 别诊 断结 果图 说明：1 8 代表1 1081 101拷贝数/反应的标准品的扩增曲线，曲线9 为阴性对照。图C.1 布鲁氏 菌通 用型 实时 定 量PCR 灵 敏度 扩增 曲线 说明：1 3 模板分别为牛种布鲁氏菌A19 株核酸、羊种布鲁氏菌M5 株 核酸、猪种布鲁氏菌S2株核酸。4 11分别为大肠杆菌、金黄色 葡萄球菌、沙门氏杆菌、溶血性链球菌、嗜肺巴氏杆菌、结核杆菌、螺旋杆菌、绿脓杆菌的核酸。12 为阴性对照。图C.2 布鲁氏 菌通 用型 实时 定 量PCR 特 异性 扩增 曲线 DB37/T 3625 2019 9 说明：A 1 1081 101拷贝数/反 应的标准品的扩增曲线。B 牛种布鲁氏菌核酸阳性的熔解曲线Tm值为：（87.8 0.5）图C.3 牛种布 鲁氏 菌灵 敏度 扩增 曲线和 阳性 结果 熔解 曲线 说明：A 1 1081 101拷贝数/反 应的标准品的扩增曲线。B 羊种布鲁氏菌核酸阳性的熔解曲线Tm值为：（86.7 0.5）。图C.4 羊种布 鲁氏 菌核 酸阳 性结 果熔解 曲线 说明：A1 1081 101拷贝 数/反 应的 标准 品的 扩增 曲 线。B 猪种 布鲁 氏菌 核 酸 阳 性的熔 解曲 线Tm 值为：（84.5 0.5）。图C.5 猪种布 鲁氏 菌核 酸阳 性结 果熔解 曲线 DB37/T 3625 2019 10 说明：A 牛种、羊种和猪种布鲁氏菌分型的熔解曲线。B SYBR Green 实时定量PCR 鉴别牛、羊和猪种布鲁氏菌气溶胶样本阳性结果熔解曲线。图C.6 牛种、羊种 和猪 种布 鲁氏 菌鉴别 检测 熔解 曲线 结果 DB37/T 3625 2019 11 D D 附 录 D（规范 性附 录）检测过 程防 止交 叉污 染的 措施 D.1 样品采 集与 运输 D.1.1 采样采 集：采集 样本 使用 独立的 气溶 胶采 样器 和收 集管。一个 气溶 胶采 样器 限于采 集一 份样 本，收集管 使用 一次 性灭 菌离 心管。防止 不同 样品 之间 通过采 样器、收 集管 交叉 污染。D.1.2 样本运 输与 贮存：防 止样 品在运 输与 贮存 过程 中包 装损坏 造成 交叉 污染。D.2 检测过 程 PCR 反 应试 剂应 按检 测需 求 分装贮 存，避 免同 一管 试 剂多次 开启 使用。装有 核 酸模板、PCR 试剂 和引物的离 心管 在打 开之 前，应短暂 离心，所 有操 作尽 量避免 产生 气溶 胶。上机 运行前，应 检查 并盖 紧各PCR管。D.3 人员要 求 采样人 员穿 一次 性无 菌隔 离服，戴一 次性 手套 和口 罩。实 验室 检测 人员 应由 具备资 格的 工作 人 员 操作。D.4 用具灭 菌 气溶胶 采样 器清 洗干 净后121 高 压灭 菌处 理20 min。D.5 仪器设 备与 耗材 使用带 滤芯 吸头。吸 头、离心管、PCR 管 等应 一次 性 使用，不得 回收 清洗 后重 复使用。D.6 实验室 实验室 应该 设有 核酸 提取 工作区、PCR 加 样工 作区 以 及荧光 定量PCR 仪放 置区，不同区 域可 密闭 进行紫外消 毒，并 配备 级生 物安全 柜A型。上述 区域 在 每次使 用后应 及时 清洁处 理，并 在使用 前后 照射 紫外30 min 以 上。每 个区 域 应有专 门的 废弃 物容 器，该容器 应能 耐受 煮沸、2%石碳酸 溶液 消毒 处理。每 次实验结 束，应在 紫外 消毒 前，及时 清理 废弃 物及 消毒 容 器，并 将该 废弃 物容 器放 回 工作区 进行 紫外 消毒。D.7 其他 应遵循 核酸 检测 实验 室其 他技术 要求。_