猕猴桃细菌性溃疡病PCR诊断技术规程DB45／T 2804-2023.pdf

ICS 65.020.01 CCS B 16 45 广 西 壮 族 自 治 区 地 方 标 准 DB45/T 2804 2023 猕猴桃细 菌性溃 疡病 PCR 诊断 技术规程 Technical code on diagnosis of bacterial canker disease of kiwifruit by PCR 2023-12-26 发布 2024-02-01 实施 广西壮族 自治 区 市场监 督管理 局 发 布 DB45/T 2804 2023 I 前 言 本文件按照GB/T 1.1 2020 标准化 工作导则 第1 部分：标准化文 件的结构 和起草规则 的规定起草。本文件由广 西壮族自 治区农业 农村厅提 出、归口 并宣 贯。本文件起草 单位：广 西特色作 物研究院。本文件主要 起草人：王明召、娄兵海、阳廷密、杨炎昌、唐明丽、门友均、何建军、宋雅琴、韩 旸、班世面。DB45/T 2804 2023 1 猕猴桃细 菌性溃 疡病 PCR 诊断 技术 规程 1 范围 本文件确立了猕 猴桃细菌 性溃疡病PCR 诊断技术 的程 序，给出了缩略 语、诊断 原理，规定 了样品采集、诊断方 法、诊断 后样品处 理的操作 指示，描 述了 技术档案作 为追溯方 法。本文件适用 于 广西壮 族自治区 行政区域 内猕猴桃 属植 物感染猕猴 桃细菌性 溃疡病的 诊断。2 规范性引用 文件 下列文件中 的内容通 过文中的 规范性引 用而构成 本文 件必不可少 的条款。其中，注日 期的引用 文件，仅该日期对 应的版本 适用于本 文件；不 注日期的 引用 文件，其最 新版本（包括所有 的修改单）适用于 本文件。本文件没有 规范性引 用文件。3 术语和定义 下列术语和 定义适用 于本文件。3.1 猕猴桃细菌 性溃疡病 bacterial canker disease of kiwifruit 由丁香假单 胞杆菌猕 猴桃致病 变种（Pseudomonas syringae pv.actinidiae）引 起的猕 猴桃病害。4 缩略语 下列缩略语 适用于本 文件。bp：碱基对 DNA：脱氧核 糖核酸（Deoxyribonucleic acid）dNTPs：四 种脱氧核 糖核苷三 磷酸（Deoxy-ribonucleoside triphosphate）的等摩 尔混合物，包括dATP、dGTP、dCTP 和dTTP PCR：聚合酶 链式反应（Polymerase Chain Reaction）Taq 酶：Taq DNA聚合 酶（Taq enzyme）pH：氢离子 浓度指数（Hydrogen ion concentration）5 诊断 原理 利用猕猴桃细菌 性溃疡病 菌DNA 特异性 扩增引物，在 热稳定DNA聚合 酶的作用下，合成大量 目标DNA片段，最终通过 凝胶电泳 分离检测出 特定大小的 猕猴 桃细菌性溃疡病 菌特异性DNA 谱带，根据该谱带 的有无确定样 品是否带 有猕猴桃 细菌性溃 疡病菌。6 样品采集 DB45/T 2804 2023 2 6.1 鉴定取样 6.1.1 采有典型和 疑似症状 的植株叶 片样品（参见附录A.1）、枝干样 品（参见 附录 A.2）。6.1.2 幼龄树每株 采 5 张叶 片，成 年树每株 采 20 张 叶片，枝 干样品采 10 cm 长一 段、共 3 段，分样品装入可密封 塑料袋中，同时在 密封袋中 放入一小 团无 菌湿纸巾，冰块冷藏 运输，3 d 内送实验 室 检测。6.2 监测取样 6.2.1 采取 Z 字型 五点取样 法，每个 点选取 3 株树采样。6.2.2 每株树在东、南、西、北四个 方位采集 叶片样品，幼 龄树每方位 采 1 张叶 片，成年 树每方位 采5 张叶片，枝 干样品采 10 cm 长一段、共 3 段，样品 保存于可密 封塑料袋 中，同时 在密封袋 中放入一 小团无菌湿纸 巾，冰块 冷藏运输，3 d 内送 实验室检测；从同一株树 上采集的 所有叶片 或枝干为 一个样品。7 诊断方法 7.1 试剂及要求 7.1.1 要求 本文件 所用 试剂为分 析纯，所 有试剂均 用高压灭 菌的 无菌容器分 装。7.1.2 试剂 主要试剂见 表1。表1 主要试剂 序号 试剂 1 液氮 2 无水 乙醇 3-巯 基乙 醇 4 植物 基因 组DNA 提取 试剂 盒 5 无菌 双蒸 水（无菌ddH2O）6 75 酒精（按 附录B 配制）7 PCR缓 冲液10，含15 mM Mg2+8 特异 性引 物对10 M 9 dNTPs2.5 mM each 10 Taq 酶5 U/L 11 DNA分 子量 标准（DNA maker，可 区分100 bp1000 bp 及 以上 的DNA 片 段）12 琼脂 糖（分子 生物 学级 别）13 上样 缓冲 液（按附 录B配 制）14 核酸 染料（Gel-Red）15 10TBE 电泳 缓冲 液（按附 录B配 制）DB45/T 2804 2023 3 7.2 仪器和用品 用具 主要仪器和 用品用具 见表2。表2 主要仪器和 用品用具 序号 仪器 和用 品用 具 1 PCR 扩 增仪 2 超微 量紫 外分 光光 度计 3 水平 电泳 仪及 其配 套设 备 4 高速 台式 冷冻 离心 机（最高 转速 在14 000 rpm 以 上）5 凝胶 成像 系统 6 微量 移液 器一 套：0.1 L 2.5 L，0.5 L10 L，10 L 100 L，20 L 200 L，200 L 1 000 L 7 冰箱（4 冰 箱、-20 冰箱、-70 以 下冰 箱）8 通风 橱 9 涡旋 振荡 仪 10 高压 灭菌 锅 11 电子 天平 12 pH计 13 水浴 锅 14 超纯 水仪 15 震荡 研磨 仪（或陶 瓷研 钵及 研杵）16 离心 管（1.5 mL、2 mL离 心管）17 PCR 反 应管 18 移液 枪头（1 mL、200 L、10 L 移 液枪 头）19 移液 枪盒 注：移液 枪盒、离 心管、PCR 反应 管、一次 性移 液枪 头、研钵 及研 杵等 应经 过高 压灭 菌（121，20 min）并 烘 干。7.3 试样制备 7.3.1 样品存放 采集的样品 经处理后，在2 8 条件下 保存应不 超 过2 周，若需长 期保存，应 置于-70 以下超低温冰箱，冻融不超 过3 次。7.3.2 样品预处理 将猕猴桃叶 片或枝干 用流水清 洗干净，吸水纸 擦干，备 用。冲洗 废液及用 过的吸水 纸进行灭 菌处理。7.3.3 存放的样品 处理 存放于-70 以下超 低温冰箱 的样品，取出后立 即放 入液氮中。7.3.4 样品DNA 提取 取0.1 g样品 组织，剪 碎后放入 震荡研磨 仪或研钵 中，加入液氮冷 冻研磨至 粉末状。采用商用植物基 因组DNA 提 取试剂盒（推荐使用 多糖 多酚类植物样品 专用基因 组DNA提取 试剂盒），按照其操作步骤 和方法提 取样品总DNA，或者选 用其 他能达到PCR 扩 增质量要求 的方法提 取样品总DNA，将提取的样 品DNA 置于-20 冰 箱保存备 用。DB45/T 2804 2023 4 7.3.5 样品总 DNA 检测 7.3.5.1 用超微量紫 外分光光 度计检测 样品总 DNA 的浓度和 A260/A280、A260/A230 比值（A260/A280在1.8 2.0 之间,A260/A230 在 1.8 2.2 之 间得到 的 DNA 纯度较 高），用 无菌 ddH2O 稀释 DNA 浓度至50 ng/L。7.3.5.2 吸取 1 L2 L 样品总 DNA 与等 体积的上 样缓冲液 混 合，加入 1琼脂 糖凝胶的 点样孔中，同时设 100 bp 梯度 DNA 标准分 子量作为 片段大小 的标 准，在 120 V 电 压下电泳 20 min 40 min。电泳 结束后，将琼 脂糖凝胶 放入凝胶 成像系统 中拍照保 存，观察 DNA 谱 带的有无、大小及 形状特征。7.4 PCR 检测 7.4.1 PCR 扩增引物 序列 正向引物 5-CAGAGGCGCTAACGAGGAAA-3；反向引物 5-CGAGCATACATCAACAGGTCA-3。7.4.2 PCR 扩增体系 PCR 扩增体系 见表1，体系总体 积25 L/管。表3 猕猴桃细菌 性溃疡病 菌 PCR 扩 增体系 检测 试剂 终浓 度 每管 加入 量/L 模板DNA 2 ng/L 1 无菌ddH2O 17.3 dNTPs2.5 mM each 0.2 mM each 2 PCR缓 冲液 1 0 1 2.5 正向 引物5 M 0.2 M 1 反向 引物5 M 0.2 M 1 Taq酶5 U/L 1 U/25 L 0.2 总体 积 25 7.4.3 PCR 扩增 按表3，依次向PCR 反应管中 加入超纯 水、dNTPs、PCR 缓冲液、正向引 物、反向 引物、Taq酶、模板DNA，低速短 暂离心后 放入PCR仪，PCR 反应 程序为：94 5 min；94 30 s，56 30 s，72 30 s，35个循环；72 10 min，4 下 保存。检测时设置空白 对照、阳 性对照（猕 猴桃细菌性 溃疡 病菌 基因组DNA）和阴性对 照（健康 猕猴桃 植株基因组DNA）。7.4.4 电泳及成像 7.4.4.1 电泳 将5 L PCR产 物与3 L 上样缓冲 液混合，加入1 琼脂 糖凝胶的点 样孔中，同时设100 bp梯度DNA 标准分子量作为 片段大小 的标准，在120 V电 压下电泳 约60 min。7.4.4.2 成像及分析 DB45/T 2804 2023 5 电泳结束后，将 琼脂糖凝 胶放入凝胶 成像系统中 拍照 保存并观察分析，观察DNA 谱带的有 无、大小及形状特征。7.4.5 结果判定 凝胶上阳性 对照应出 现一条311 bp大小 的特异性 条带，阴性对照应没 有该特异 性条带；供试 样品若出现与阳性 对照相同 大小的特 异性条带，则判定样 品 为阳性，即带猕 猴桃细菌 性溃疡 病菌；供试样 品若未出现与阳 性对照相 同大小的 特异性条 带，样品为 阴 性，即不带猕猴 桃细菌性 溃疡病 菌。结果判定 参见附录C。8 诊断后样品 处理 DNA 提取液放置于-20 以下，以备复检。用于猕猴 桃细菌性 溃疡病菌检测的植物样品、用具，以及实验操作 台面和废 液在完成 检验后，植 物样品集 中 处理，用具及废 液进行 灭 活处理，实 验操作台 面用75 酒精杀 菌。9 技术 档案 建立猕猴桃 细菌性溃 疡病诊断 档案，详 细记录诊 断过 程中样品采 集、处理、检测等 情况。DB45/T 2804 2023 6 A A 附录A（资料性）猕猴桃细菌 性溃疡病 症状特征 A.1 叶片症状特 征 叶片发病时在新 生叶片上 呈现褪绿小 点，水浸状，后 发展为1 mm3 mm的不规则 形或多角 形褐色病斑，边缘有 明显的淡 黄色晕圈。高温条 件下病斑 呈红 色，在连续 阴雨低温 条件下，病斑扩展 很快，有 时也不产生黄 色晕圈。叶片上产 生的许多 小病斑相 互融 合形成枯斑，叶片边 沿 向上翻 卷，不易 脱落。秋 季叶片病斑呈 暗紫色或 暗褐色，容易脱落。症状特 征见 图A.1。图A.1 叶片症状特 征 A.2 枝干症状特 征 感病植株最 初从发病 部位芽眼、叶痕、皮孔、小 伤口 等处溢出乳 白色粘质 菌脓，划 破皮层可 见韧皮部开始变为 深灰色腐 烂。病部皮 层组织逐 渐变软呈 水 浸状下陷，树干 或大枝上 可出现 纵向裂缝。植 株进入伤流期后，病 部的菌脓 与伤流 液混合从 伤口漫溢 出，呈锈红色。病斑 扩展绕茎 一周后导 致发病部 以上的枝干坏死，也会向 下部扩展 导致地上 部分枯死 或整 株死亡。症 状特征见 图A.2。图A.2 枝干症状特 征 DB45/T 2804 2023 7 B B 附录B（资料 性）试剂和溶液 配制 试剂和溶液 的配制见 表B.1。表B.1 试剂和溶液 配制 试剂 和溶 液 配制 方法 75 酒精 用75 mL 无水 乙醇 和25 mL 无菌ddH2O配制 上样 缓冲 液 溴酚 蓝0.009 g，二 甲苯 蓝0.009 g，甘油6 mL，0.5 mmol/L pH 8.0 EDTA 1.2 mL，无菌ddH2O 5.6 mL 10TBE Tris 108.0 g，EDTA 9.3 g，硼 酸55.0 g溶 于适 量无 菌ddH2O 后，定容 至1 000 mL，调节pH为8.0，高温 灭菌 后保 存备 用，使 用时配 制成1 TBE 或0.5 TBE 稀释 缓冲 液 1 琼 脂糖 凝胶 称取1 g 琼脂 糖溶 于100 mL1 TBE 或0.5 TBE 稀 释缓 冲液 中，加热 至完 全溶 解，待 温度 降至70 C 左右，加 入1 L 核 酸染 料（Gel-Red），充分 混匀 后，倒入 制胶 槽中 即可 DB45/T 2804 2023 8 C C 附录C（资料性）猕猴桃细菌 性溃疡病 样品 PCR 检测电泳 图 猕猴桃细菌 性溃疡病 样品PCR 检 测电泳图 见图C.1。注：M：DNA marker；1：空 白对 照；2：阳 性对 照；3：阴性 对照；413：带 病样 品；1417：不带 病样 品。图C.1 猕猴桃细菌 性溃疡病 样品 PCR 检测电泳 图