水产养殖环境（水体、底泥）中大环内酯类抗生素的测定液相色谱-串联质谱法DB43／T 2991-2024.pdf

ICS 65.020 CCS B30 43 湖南省地方标准 DB 43/T 29912024 水产养殖环境（水体、底泥）中大环内酯类抗生素的测定 液相色谱-串联质谱法 Determination of macrolide antibiotics in water and sediment from aquaculture environmentLiquid chromatography-tandem mass spectrometry 2024-05-13 发布 2024-07-13 实施 湖南省市场监督管理局 发 布 DB 43/T 29912024 I 目 次 前言.II 1 范围.1 2 规 范性 引用 文件.1 3 术 语和 定义.1 4 方法 原理.1 5 试 剂与 材料.1 6 仪 器与 设备.2 7 样品.2 8 测定 步骤.3 9 结 果计 算和 表述.5 10 检测 方法 的灵 敏度、准 确度 和精 密度.6 附录A（资 料性）大环 内酯 类药 物中 英文通 用 名称、化 学分 子式 和CAS 号.7 附录B（资 料性）标准 溶液 特征 离子 质量色 谱 图.8 DB 43/T 29912024 II 前 言 本文件 按照GB/T 1.12020 标准 化工 作导则 第1 部 分：标准 化文 件的 结构 和起 草规 则的 规定起草。请注意 本文 件的 某些 内容 可能 涉及 专利。本 文件的 发布 机构 不承 担识 别专 利的 责任。本文件 由湖 南省 农业 农村 厅提 出。本文件 由湖 南省 农业 标准 化技 术委 员会 归口。本文件 起草 单位：湖 南省 水产 科学 研究 所、农业农 村部 渔业 产品 质量 检验 测试 中心（长 沙）、澧县农产品 质量 安全 检测 中心、长 沙市 雨花 区农 业农村 局。本文件 主要 起草 人：万 译文、杨 霄、何咏、李小玲、谢 仲桂、崔先 锋、曾春 芳、索纹纹、陈湘 艺、刘伶俐、雷 琴、肖维、洪 波、尹升 福、谢玉 昆、黄 向荣、黄 华伟、杨 宇。DB 43/T 29912024 1 水产养殖环境（水体、底泥）中大环内酯类抗生素的测定 液相色谱-串联质谱法 1 范围 本文件 描述 了水 产养 殖环 境（水体、底 泥）中大环 内酯 类抗 生素 的液 相色 谱-串联 质谱测 定 方法。本 文 件适 用于 水产 养殖 环境（水体、底泥）中 脱 水红 霉素、罗红 霉素、克拉 霉素、竹桃霉 素、吉他霉素、交沙 霉素、泰 乐菌 素、替米 考星 的测 定。2 规范性 引用 文件 下列文 件中 的内 容通 过文 中的 规范 性引 用而 构成本 文件 必不 可少 的条 款。其 中，注日 期的 引用文 件，仅 该 日期 对应 的版 本适 用于 本文 件；不注 日期 的 引用 文件，其 最新 版本（包 括所 有的 修改 单）适用 于本文件。GB/T 6682 分析 实验 室用 水规 格和 试验方 法 GB 17378.5 海洋 监测 规范 第5部分：沉积 物 分析 SC/T 9102.3 渔业 生态 环境 监测 规范 第3 部分：淡水 3 术语和 定义 本文件 没有 需要 界定 的术 语和 定义。4 方法原 理 水试样 中的 大环 内酯类 抗生 素经 HLB 固 相 萃取柱 富集 和净 化，底 泥试 样中 的大环 内酯 类抗生 素经氨 化 乙腈 提取，PSA 和C18 吸附 剂净 化。净化 后的 溶 液用 带有 电喷 雾离 子源 的液 相色 谱-串 联质谱 仪测 定，内标法 定量。5 试剂与 材料 试剂 5.1.1 水：GB/T 6682 规定 的一 级水。5.1.2 甲醇（CH3OH）：色谱 纯。5.1.3 乙腈（CH3CN）：色谱 纯。5.1.4 甲酸（HCOOH）：色谱 纯。5.1.5 氯化钠（NaCl）：分析 纯。5.1.6 氨水（NH3 H2O）：分析 纯，浓度 为25%28%。5.1.7 无水硫 酸镁（MgSO4）：分析 纯。5.1.8 乙二胺 四乙 酸二 钠（Na2EDTA）：分 析纯。溶液配 制 DB 43/T 29912024 2 5.2.1 0.1%甲酸 水溶 液：取甲 酸 0.5 mL，用 水稀 释至 500 mL。5.2.2 甲酸-乙腈 溶液：取 乙腈 30 mL，用0.1%甲 酸水溶 液稀 释至100 mL。5.2.3 1%氨化 乙腈：取 氨水5 mL，用乙 腈稀 释至 500 mL。标准品 5.3.1 大环内 酯类 抗生 素：脱 水红 霉素、罗 红霉素、克拉 霉素、竹 桃霉素、吉 他霉 素、交沙霉 素、泰乐菌素、替 米考 星，纯度 均大 于等 于95.0%，具体 内容 见附 录A。5.3.2 内标：罗红 霉素-D7，纯度 大于 等于 95.0%，具体内 容见 附录A。标准溶 液配 制 5.4.1 标准储 备液（100 g/mL）：取大 环内 酯类 抗 生素标 准品 各约 10 mg，精密 称定，用 甲醇 溶解并稀释至100 mL，配 制成 浓度 均为 100 g/mL 的标准 储备 液。4 避 光保 存，有效 期3 个月。5.4.2 内标标准储 备 液（100 g/mL）：取罗 红霉 素-D7 标准 品约 10 mg，精 密称 定，用甲 醇溶 解 并稀释至100 mL，配 制成 浓度 为100 g/mL 的 内标 标准储 备液。4避 光保 存，有效 期3 个月。5.4.3 混合标 准工 作液（1.0 g/mL）：分别 精密 量 取标准 储备 液各 1 mL，于 100 mL 容量 瓶中，用甲醇稀释 至刻 度，配制 成浓 度为 1.0 g/mL 的混 合 标准 工作 液。4 避光 保存，有 效期 1 个月。5.4.4 内标标 准工 作液（1.0 g/mL）：精 密量 取内标 标 准储 备液 1 mL，于 100 mL 容 量瓶 中，用甲醇稀释至 刻度，配 制成 浓度 为 1.0 g/mL 的内 标标准 工作 液。4 避 光保 存，有效 期1 个月。材料 5.5.1 HLB（二 乙烯 苯和N-乙烯 基吡 咯烷 酮共 聚物）固 相萃 取柱：500 mg/6 mL，或 相当 者。5.5.2 PSA（N-丙基 乙二 胺）吸附 剂：粒径40 m 63 m，或 相当 者。5.5.3 C18（十 八烷 基键 合硅 胶）吸附 剂：粒径40 m 63 m，或 相当 者。5.5.4 玻璃纤 维滤 膜：0.45 m。5.5.5 尼龙滤 膜：0.22 m。6 仪器与 设备 液相色 谱-串联 质谱 仪：配有 电喷 雾离 子源。分析天 平：感量0.01 g 和0.00001 g。冷冻干 燥机。涡旋混 合器。高速离 心机：转 速大 于等 于10000 r/min。超声波 清洗 器。固相萃 取装 置。氮吹仪。旋转蒸 发仪。pH 计。7 样品 样品采 集 DB 43/T 29912024 3 水样和 底泥 样品 按照SC/T 9102.3 规定 的方 法进行 采集。试样制 备 水样采 样量 应不 少于 1 L，经0.45 m 玻璃纤 维 滤膜 过滤，置 于棕 色样 品瓶 中，0 4 避 光保存，一 周内 完成 分析。底泥 样品 采样 量应 不 少于 500 g，于-20 预 冷冻 24 h，经冷 冻干 燥机（-50，真空度 小于 20 Pa，冷冻 干燥 10 h）冻干，剔除石 块和 植物 体等 异物，用研 钵研 磨后 过 孔径 0.25 mm 网筛，置 于棕 色样 品瓶 中，0 4 避 光保 存，一 个月 内完 成分 析。空白试 样制 备 选取不 含大 环内 酯类 抗生 素的 同类 样品，按 照7.2 进 行制 备。8 测定步 骤 提取 8.1.1 水 准确移 取 100 mL 试样，用甲 酸调 节pH 至6.0（0.2），加 入 50 L 内 标标 准工 作液，再加入0.1 g 乙二 酸四 乙酸 二钠，混 合均 匀。无需 提取，待 净化。8.1.2 底泥 称取 2 g（准 确至 0.02 g）试 样于 50 mL 离心管 中，加入 2 mL 水润 湿，加入 200 L 内标标 准工作 液，加入1%氨化 乙腈 10 mL，涡 旋混合 1 min，超声 提取 10 min，加 入氯 化钠 2 g，涡 旋混合 1 min，6000 r/min 离心8 min，取 上清 液并 转移 至20 mL 具塞 刻度 试管 中，残渣 用10 mL 1%氨化 乙 腈重 复提取一次，合 并上 清液，用乙 腈定 容至 20 mL，混匀，备 用。净化 8.2.1 水 HLB 固相 萃取 柱依 次用 5 mL 甲 醇、5 mL 水活 化。取 水样 过柱，控 制流 速不 超过 5 mL/min。待水 样全部通 过小 柱后，用10 mL 水 淋洗，减 压抽 干，用8 mL 甲醇 洗脱。收 集洗 脱液，于45 下氮 气吹 至近干。加入1 mL 甲酸-乙腈 溶液 溶解 残渣，过 0.22 m 尼龙 滤膜，供 液相 色谱-串联 质 谱仪测 定。8.2.2 底泥 移取10.00 mL 上述 备用 液至50 mL 离 心管 中，加 入无 水硫 酸镁 600 mg，PSA 吸 附剂100 mg，C18 吸附剂40 mg，涡旋 振荡 1 min，10000 r/min 离心5 min，转移 上清 液至 50 mL 茄形 瓶中，于45 下减压浓 缩至 近干，加 入2 mL 甲酸-乙腈 溶液 溶解残 渣，过0.22 m 尼龙 滤膜，供 液相 色谱-串 联质 谱仪测定。底泥试 样含 水率 测定 按照GB 17378.5 规定 的方 法进 行测 定。标准曲 线制 备 DB 43/T 29912024 4 精密量 取混 合标 准工作 液、内标 标准 工作液 适量，用甲 酸-乙腈 溶液 配制成 大环 内酯 类 抗生素 浓度为0.5 g/L、1.0 g/L、5.0 g/L、10.0 g/L、20.0 g/L 和50.0 g/L 的系 列混 合标准 工 作液，其中内标 溶液 的浓 度均为50 g/L，供液 相色谱-串联 质谱 仪测 定。以待 测物 和内 标物 特征 离子质 量色 谱峰峰面积 比值 为纵 坐标、对应 的待 测物 标准 溶 液浓度 为横 坐标，绘 制标 准曲 线，计 算回 归方 程和相 关系 数。测定 8.5.1 液相色 谱参 考条 件 液相色 谱参 考条 件如 下：a)色谱柱：C18(100 mm2.1 mm，粒径 2.6 m)，或 相当 者；b)流动相：A 为乙 腈，B 为0.1%甲酸 水溶 液，梯 度 洗脱 条件 见表1；c)进样量：5 L；d)流速：0.3 mL/min；e)柱温：40。表1 流动相 梯度 洗脱 条件 时间 min A%B%0 10 90 1.0 10 90 7.0 85 15 8.0 85 15 8.1 10 90 10.0 10 90 8.5.2 质谱参 考条 件 质谱参 考条 件如 下：a)离子源：电 喷雾 离子 源；b)扫描方 式：正离 子扫 描；c)检测方 式：多反 应监 测（MRM）；d)喷雾电 压：5.5 kV；e)脱溶剂 气温 度：550；f)多反应 监测 母离 子、子离 子、去簇 电压 和碰 撞能量 见表2。表2 多反应 监测 母离 子、子离 子、去簇 电压 和碰 撞能量 化合物名称 母离子 m/z 子离子 m/z 去簇电压 V 碰撞能量 eV 脱水红霉素 716.5 558.4a 100 24 158.1 100 40 罗红霉素 837.5 679.5 a 106 32 158.1 106 42 DB 43/T 29912024 5 表2 多反 应监 测母 离子、子 离子、去 簇电压 和 碰撞 能量（续）化合物名称 母离子 m/z 子离子 m/z 去簇电压 V 碰撞能量 eV 克拉霉素 748.4 158.1a 88 38 590.3 88 29 竹桃霉素 688.4 544.4 a 107 25 158.1 107 38 吉他霉素 772.4 174.3 a 72 43 109.3 72 60 交沙霉素 828.4 174.1 a 90 43 109.3 90 60 泰乐菌素 916.4 174.1 a 81 50 772.2 81 45 替米考星 869.5 696.4 a 112 58 174.1 112 57 罗红霉素-D7 844.5 158.1 a 106 42 a 定量 离子。8.5.3 定性测 定 在相 同测试条件 下，试样中 待测物的保 留时间与 标准工作液 中待测物的 保留时间一 致，偏差 在2.5%以内，且 试样中待测物 定性离子的 相对丰度 与浓度相当的 标准溶液对 应的定性离子的相 对丰度一致。其 允许 偏差 见表3。表3 定性确 证时 相对 离子 丰度 的最 大允 许偏 差 相对离子丰度/%50 2050 1020 10 允许偏差/%20 25 30 50 8.5.4 定量测 定 按8.5.1 和8.5.2 设 定仪 器条 件，取标 准工 作溶液、试 样溶 液、空白 试样 溶液 等体 积进 样测定，内标法定 量，其中 脱水 红霉 素、罗红 霉素、克 拉霉素、竹桃 霉素、吉 他霉 素、交沙 霉素、泰乐菌 素、替 米考星以 罗红 霉素-D7 为内 标。标准 工作 溶液 和试样 溶液 中目 标物 的响 应值 均应 在仪 器检 测线性 范围 内。大环内 酯类 抗生 素标 准溶 液特 征离 子质 量色 谱图参 见附 录B。空白实 验 按照8.18.5 相同 的测 定步 骤进 行空 白试样（见7.3）的 测定。9 结果计 算和 表述 水样中 待测 物含 量 DB 43/T 29912024 6 水样中 待测 物含 量按 式（1）计算。计 算结果 应 扣除 空白 值，保留 2 位 有效 数字。1=0(1)式中：1试样 中待 测物 的含 量，单位 为微 克每 升（g/L）；从 标准 工作 曲线 得到 的待 测物 溶液 浓度，单位 为微 克每 升（g/L）；试样 最终 定容 体积，单 位为 毫升（mL）；0 试样 体积，单 位为 毫升（mL）；底泥中 待测 物含 量 底泥中 待测 物含 量按 式（2）计算。计 算结果 应 扣除 空白 值，保留 2 位有 效数 字。2=1 2(1)(2)式中：2试样 中待 测物 的含 量，单位 为微 克每 千克（g/kg）；从标 准工 作曲 线得 到的 待测 物溶 液浓度，单位 为微 克每 升（g/L）；试样 最终 定容 体积，单 位为 毫升（mL）；1试样 提取 液体 积，单位 为毫 升（mL）；2准确 移取 的备 用液 体积，单 位为 毫升（mL）；试样 质量，单 位为 克（g）；试样 含水 率，单位 为质 量分 数（%）。10 检测方 法的 灵敏 度、准确 度和 精密 度 灵敏度 本方法 在水 产养 殖环 境水 中 8 种大 环内 酯类抗 生 素的 检出 限均 为 0.002 g/L，定 量限 均为 0.005 g/L；在水 产养 殖环 境底 泥中8 种大 环内 酯类 抗 生素 的检 出限 均为0.5 g/kg，定 量限 均为 1.0 g/kg。准确度 本方法 水在0.005 g/L0.5 g/L 添 加浓 度水平 上的 回收 率为70%120%；底 泥在1 g/kg 100 g/kg 添加 浓度 水平 上的 回收 率为 60%120%。精密度 本方法 的批 内相 对标 准偏 差小 于等 于15%，批 间 相对 标准 偏差 小于 等于15%。DB 43/T 29912024 7 A A 附录A（资料 性）大环内 酯类 药物 中英 文通 用名 称、化学 分子 式和CAS 号 大环内 酯类 药物 中英 文通 用名 称、化学 分子 式和CAS号 见表A.1。表A.1 大环内 酯类 药物 中英 文通 用名 称、化学 分子 式和CAS 号 中文通用名称 英文通用名称 化学分子式 CAS号 脱水红霉素 Anhydroerythromycin A C37H65NO12 23893-13-2 罗红霉素 Roxithromycin C41H26N2O15 80214-83-1 克拉霉素 Clarithromycin C38H69NO13 81103-11-9 竹桃霉素 Oleandomycin C35H61NO12 3922-90-5 吉他霉素 Kitasamycin C40H67NO14 1392-21-8 交沙霉素 Josamycin C42H69NO15 16846-24-5 泰乐菌素 Tylosin C46H77NO17 1401-69-0 替米考星 Tilmicosin C46H80N2O13 108050-54-0 罗红霉素-D7 Roxithromycin-D7 C41H69D7N2O15 2095110-69-1 DB 43/T 29912024 8 B B 附录B（资料 性）标准溶 液特 征离 子质 量色 谱图 标准溶 液特 征离 子质 量色 谱图 见图B.1。a）脱 水红 霉素 定量 离子 色谱 图 b）罗红 霉素定 量离 子色 谱图 c）克 拉霉 素定 量 离子色 谱图 d）竹 桃霉 素定 量离 子色 谱图 e）吉 他 霉素定 量离 子色 谱图 f）交沙 霉素 定量 离子色 谱图 g)泰 乐菌 素定 量离 子色 谱图 h）替 米考 星定量 离子 色谱 图 i）罗 红霉 素-D7 定 量离子 色 谱图 图B.1 大环 内酯 类抗 生素 标准 溶液 特征 离子 质量色 谱 图（10.0 g/L）