鱼类口服抗菌药物选用技术规程DB11／T 1397-2017.pdf

ICS 65.150 B 50 DB11 北京市地方标准 DB11/T 1397 2017 鱼类口服抗菌药物选用技术规程 The technical protocol of screening oral antibacterials for fish 2017-03-22发布 2017-07-01实施 北京市质量技术监督局 发布 DB11/T 1397 2017 I 前 言 本标准根据 GB/T 1.1 2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由北京市农业局提出并归口。本标准由北京市农业局组织实施。本标准起草单位：北京市水产技术推广站。本标准主要起草人：王小亮、王静波、王姝、曹欢、张文、王澎、徐立蒲、那立海。DB11/T 1397 2017 1 鱼类口服抗菌药物选用技术规程 1 范围 本标准规定了鱼类口服抗菌药物选 用原 则、程序和操作流程。本标准 适用于养殖 鱼类 细 菌 感染判断和治疗时 口服抗菌药物选 用。2 规范性引用文件 下列 文件 对于 本文件的 应用是必 不可 少 的。凡是 注 日期 的 引用 文件，仅所 注 日期 的 版 本 适用于 本文件。凡是 不注 日期 的 引用 文件，其最新版 本（包括所有 的 修改 单）适用于 本文件。GB/T 6682 分析 实 验室用 水规 格和试验方法 GB/T 27623.1 2011 渔用 抗菌药物药 效试验 技术规 范 第 1部分：常量肉汤稀释法 药物 敏感性试验 SC/T 7014 2006 水 生动 物 检疫 实 验 技术规 范 SC/T 7201.1 2006 鱼类 细 菌 病检疫 技术规 程 第 1部分：通用 技术 3 药物选用原则和程序 3.1 原则 抗菌药物 使用应遵循以下原 则：药物 种 类 应符合国家有关 标准，药 品应获得国家批 准文 号；选 择 GMP认证企 业 生 产的抗菌药物；使用 的 优先顺序是 磺胺 类 四环素 类 氨基糖苷 类 氟喹诺酮 类 酰胺醇 类。3.2 程序 鱼类口服抗菌药物的选 用程序 参见附录 A。4 操作流程 4.1 病鱼采集 病 鱼 采集按 SC/T 7014 2006第 6章 的规定 进行。4.2 病原菌的分离 病原 菌的 分 离参见附录 B。附录 B中 的 BHIA的 培 养 基配 方 参见 C.1。4.3 细菌感染判断 任 何一个划线 分 离平板，线上 有 菌 落或 菌 带，则 该样 品 来源 养殖 池塘 的鱼类 宜 用 口服抗菌药物；反之，则不 必使用。DB11/T 1397 2017 2 4.4 敏感药物筛选 采取纸片扩散 法（参见 D.3）筛 选 敏感 药物 种 类。依 检 测结果 选 择敏感 药物 种 类，原 则 如 下：一个样 品仅获得 一株 病原 菌，选 择 该 菌的 敏感 药物 种 类；一个样 品获得 多株 病原 菌，选 择 共同 的 敏感 药物 种 类；一个样 品获得 多株 病原 菌，且无共同 的 敏感 药物 种 类，选 择 内 脏器官 分 离 菌的 敏感 药物 种 类，优先 选 取肝、肾 分 离 菌的 敏感 药物 种 类。4.5 用药剂量确定 4.5.1 检测病原菌的最小抑菌浓度（Minimum Inhibitory Concentration，MIC）采 用 浓度梯度 稀释法（参见 D.4）检 测 其对 样 品所有病原 菌的 MIC值。4.5.2 计算样品每千克鱼的日用药剂量 按 4.5.1检 测样 品所有病原 菌的 MIC值，同 种 药物选 取 最 大 的 MIC值。每 种敏感 药物 按公式（1）计算 样 品 每千克 鱼的 日用 药 剂 量，每千克 鱼的 日用 药 剂 量 不 超过 国家 兽 药规定的 使用 许 可 值。r=S MIC U.(1)式中：U 每千克 鱼的 日 药物 使用 剂 量（指 有效 成 分 剂 量），单位 为毫克每千克（mg/kg）；MIC 抗菌药物 对病原 菌的 MIC值，单位 为毫克每升（mg/L）；S 系 数，鲤科 鱼类 为 8.1，冷 水鱼类 为 9.4，养殖 者 可 依 经 验 微调 该系 数；r 水的 密 度，数 值 约 为 1，单位 为千克每升（kg/L）。4.5.3 计算样品池塘的日药物总使用剂量 每 种敏感 药物 按公式（2）计算样 品 池塘 的 日 总 用 药 剂 量。1000=T U M.(2)式中：M 样 品 池塘 的 日 药物 总 使用 剂 量（指 有效 成 分 剂 量），单位 为克（g）；U 每千克 鱼的 日 药物 使用 剂 量（指 有效 成 分 剂 量），单位 为毫克每千克（mg/kg）；T 样 品 池塘 养殖 鱼类的 总重 量，单位 为千克（kg）。4.6 使用方法 将 样 品 鱼 来源池塘 的 饵料 日 投喂 量 减 少 一 半。将 4.5.3确 定的 日 药物 总 使用 剂 量 溶解拌入饵料 中，充 分 混匀，一 次 性 投喂 使用。4.7 用药效果评价 用 药 后，按 以下原 则 判断用 药 效 果：如 用 药 后 3 d 5 d，日 死亡数 量 明显 下 降 或 疾 病 的 症状 改 善甚至消失，则 认 定药物 治疗有效；如 用 药 后 3 d 5 d，鱼的 日 死亡数 量 保持 治疗 前 的水 平或 者 超过 治疗 前 的水 平，则 认 定药物 治疗 无 效。DB11/T 1397 2017 3 A A 附 录 A（资料性附录）鱼类口服抗菌药物选用程序 图 A.1 鱼类口服抗菌药物选用程序示 意 是 否 发 病 池 敏感 药物 筛 选 用 药 剂 量 确 定 使用方法 病 鱼不 用 抗菌药物 治疗 及 用 药 效 果 评 价 平板线上 是 否 有 菌 落或 菌 带 病 鱼 采集 病原 菌的 分 离 DB11/T 1397 2017 4 B B 附 录 B（资料性附录）病原菌的分离 B.1 设备 和 材 料 B.1.1 普 通 天 平：0 g 210 g，精确至 0.01 g。B.1.2 高压灭 菌 锅。B.1.3 微 波 炉。B.1.4 生 物 安全柜 或超 净工 作 台。B.1.5 生 物 显微镜：10，40，100。B.1.6 培 养 皿：直径 90 mm。B.1.7 酒精灯、解剖盘、解剖刀、剪子、镊子、接 种 环（针）、三角烧瓶（500 mL）等。B.1.8 试 剂 和 培 养 基 B.1.9 水：GB/T 6682，二级。B.1.10 脑心浸液琼脂（Brain Heart Infusion Agar,BHIA）：参见 C.1。B.2 取 样 部位 病 灶、肝、肾、脾、性 腺、脑。B.3 病原菌分离 B.3.1 冷水 鱼病原菌分离 用 接 种 环 从 取样 部 位 蘸 取 病 料，无 菌 操作 划线 接 种于 BHIA平板，22 2 培 养 24 h 48 h，无菌 生 长 时 继续 培 养 至 5d。B.3.2 温水 鱼病原菌分离 用 接 种 环 从 取样 部 位 蘸 取 病 料，无 菌 操作 划线 接 种于 BHIA平板，28 2 培 养 24 h 48 h，无 菌 生 长 时 继续 培 养 至 5d。DB11/T 1397 2017 5 C C 附 录 C（资料性附录）培养基 的 配制 方法 C.1 脑心浸液琼脂（BHIA）C.1.1 成 分 牛 脑浸 粉 12.5 g 牛 心浸 粉 5.0 g 蛋白胨 10.0 g 葡萄 糖 2.0 g 氯化钠 5.0 g 磷酸氢 二 钠 2.5 g 琼脂 10 g 蒸馏 水 1000 mL C.1.2 制 法 将 C.1.1 中 各 成 分 混匀，加热 溶解，调 pH至 7.4 0.1，121 高压灭 菌 20 min，冷至 50 左右，倾制 平板。C.2 水解酪蛋白琼脂（MHA）C.2.1 成 分 牛 肉 浸 膏 6.0 g 酸 水 解 酪蛋白胨 17.5 g 可 溶 性 淀粉 1.5 g 琼脂 17.0 g 蒸馏 水 1000 mL C.2.2 制 法 将 C.2.1中 各 成 分 混匀，加热 溶解，调 pH至 7.3 0.1，121 高压灭 菌 15 min，冷至 50 左右，倾 制 平板。平板中 的 培 养 基 厚 度 4 mm。C.3 水解酪蛋白肉汤（MHB）C.3.1 成 分 牛 肉 浸 膏 6.0 g 酸 水 解 酪蛋白胨 17.5 g 可 溶 性 淀粉 1.5 g DB11/T 1397 2017 6 蒸馏 水 1000 mL C.3.2 制 法 将 C.3.1中 各 成 分 混匀，加热 溶解，调 pH至 7.3 0.1，121 高压灭 菌 15 min。如 检 测 链球 菌，临 用 前 加 无 菌 血清 0.5%。DB11/T 1397 2017 7 D D 附 录 D（资料性附录）病原菌的药物敏感性检测 D.1 设备 和 材 料 D.1.1 恒温 培 养 箱：0 60。D.1.2 精密天 平：精确至 0.0001 g。D.1.3 高压灭 菌 锅。D.1.4 比浊仪。D.1.5 生 物 安全柜 或超 净工 作 台。D.1.6 生 物 显微镜：10，40，100。D.1.7 微 量 移 液 器：100 L 1000 L，10 L 100 L。D.1.8 多 通 道移 液 器：50 L 300 L。D.1.9 培 养 皿：直径 90 mm。D.1.10 试 管、试 管架：15 mm 150 mm，15 mm 100 mm。D.1.11 微 孔 板（500 L/孔）。D.1.12 一 次 性 针 头 过 滤 器（0.22 m）、注 射 器（5 mL）。D.2 试 剂和 培养基 D.2.1 水：GB/T 6682，二级。D.2.2 0.45%氯化钠缓冲 液。D.2.3 二 甲 基 甲 酰胺：分析 纯。D.2.4 氢氧化钠：分析 纯。D.2.5 75%酒精。D.2.6 药 敏 纸片。-20 保 存，药物 种 类及 其 溶解 试 剂见 表 D.1。药 敏 纸片 可 从 可 靠 的 供 应 商 采 购 或 自 行 制备。D.2.7 抗菌药物标准 品。抗菌药物 种 类 参见 表 D.1，标准 品 由 兽 药 管理 部 门 指 定单位提 供。D.2.8 水 解 酪蛋白 琼脂（Mueller-Hinton Agar,MHA）：参见 C.2。D.2.9 水 解 酪蛋白 肉汤（Mueller-Hinton Broth,MHB）：参见 C.3。D.3 纸片扩散 法 D.3.1 制备 菌 悬液 从 培 养 16 h 24 h的 BHIA斜面 上 挑 取 纯 培 养 菌，用 0.45%氯化钠缓冲 液 配 制 成 1.0 108CFU/mL 2.0 108 CFU/mL的菌 悬 液。D.3.2 接种平板 制好 的菌 悬 液 应 在 15 min内 使用。用 微 量 移 液 器取 100 L到 MHA平板上，灭 菌 玻璃涂 布 棒涂 匀。DB11/T 1397 2017 8 D.3.3 贴 药敏 纸片 用 灭 菌的 镊子 取 药 敏 纸片 贴到 D.3.2接 种 好 的 MHA平板上，镊子 轻 按 药 敏 纸片，使 药 敏 纸片 与 培 养 基 紧 密 相贴。每个培 养 皿 均 匀 贴 四片，标 记 药物 名称、菌 株 名称 和 培 养时 间 等。于 28 2(杀鲑气 单胞 菌 为 22 2)孵 育 15 min。D.3.4 测抑菌 圈直径 将 D.3.3孵 育 后 的 平板 倒置 于 28 2(杀鲑气 单 胞 菌 为 22 2)生 化 培 养 箱 中，培 养 24 h 2 h后，观察 结果。用 游 标 卡尺 或 直 尺 测 量 抑 菌 圈 直径（mm）。D.3.5 结 果 解释 按 照 表 D.1的标准 对 抑 菌 圈 大 小 作 出 解 释，判断病原 菌 对 抗菌药物 敏感 或 耐 药。表 D.1 鱼类病原菌的抑菌 圈直径解释 标准和 相对应 的最 低 抑菌浓度 值（MIC）药物 种 类 药 名 配 制 母 液 的 溶 剂 药 敏 片 含 量（g/片）MIC（mg/L）抑 菌 圈 直径（mm）敏感 耐 药 耐 药 敏感 磺胺 类药物 磺胺 甲 噁唑 1 mol/L NaOH 300 100 350 14 17 磺胺 类药物 磺胺 嘧啶 1 mol/L NaOH 300 100 350 14 17 磺胺 类药物 磺胺 二 甲 嘧啶 1 mol/L NaOH 300 100 350 14 17 磺胺 类药物 磺胺 间甲氧 嘧啶 1 mol/L NaOH 300 100 350 13 17 四环素 类 盐 酸 多 西 环素 蒸馏 水 30 4 16 13 16 氨基糖苷 类 硫 酸 新 霉 素 蒸馏 水 10 4 16 12 16 酰胺醇 类 氟 苯尼考 0.1 mol/L二 甲 基 甲 酰胺 30 4 16 13 18 酰胺醇 类 甲 砜霉 素 0.1 mol/L二 甲 基 甲 酰胺 30 4 16 12 16 氟喹诺酮 类 恩 诺 沙星 2.5 mol/L NaOH 5 2 8 12 16 D.4 浓度 梯 度 稀释 法 D.4.1 菌 悬液制备 按 D.3.1制备 的菌 悬 液，用 灭 菌的 MHB稀释 100倍 备 用。D.4.2 抗菌药物的 配制 将 不 同 种 类的抗菌药物 用 相 应 溶 剂 溶解后（参见 表 D.1），用 蒸馏 水 稀释、定容。磺胺 类药物 配成10240 mg/L的 原 液，其 它 药物 配成 1280 mg/L。用 一 次 性 针 头 过 滤 器过 滤 后，4 冰 箱 保 存，2 d内 使用。D.4.3 抗菌药物药 液 浓度 梯 度的 建立 操作方法 按 GB/T 27623.1 2011中 的 第 5.2条款执 行。D.4.4 菌 液接种 在 上 述 制备 的药 液 浓度梯度 的 试 管 中，每 管加 0.1mL的 新 鲜 配 制好 的 待 测 菌 悬 液，混匀。D.4.5 孵育 DB11/T 1397 2017 9 接 种 菌 悬 液后，尽快置 于 28 2(杀鲑气 单 胞 菌 为 22 2)下 培 养 24 h 48 h，每 24 h观察 并 记 录一 次 结果。D.5 结 果 记 录 按 GB/T 27623.1 2011中 的 5.5条款执 行。_