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ICS 65.020.01 B 30 DB15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 1626 2019 灵芝菌种 生产技术 规程 Regulation of Strain Manufacture for Mythic Fungus 2019-04-10 发布 2019-07-10 实施 内 蒙 古 自 治 区 市 场 监 督 管 理 局 发布 DB15/T 1626 2019 I 前 言 本 标准 按照GB/T 1.1-2009 给出的 规则 编写。本标准 由内 蒙古 自治 区农 牧业科 学院 提出。本标准 由内 蒙古 自治 区农 业标准 化技 术委 员会（SAM/TC 20）归 口。本标准 起草 单位：内 蒙古 自治区 农牧 业科 学院、食 用菌内 蒙古 自治 区工 程研 究中心。本标准 主要 起草 人：李 亚 娇、孙国 琴、王海 燕、庞杰、于 传宗、高 天云、潘 永圣、云 利俊、郭 俊波、宋秀敏、李 国银、陈 友君。DB15/T 1626 2019 1 灵 芝菌种 生产技术 规程 1 范围 本标准规 定了 制作灵 芝（Ganoderma lucidum）母 种、原种和 栽培 种有关 的定 义、制 作技术 流程要点等。本标准 适用 于工 厂化 生产 企业或 专业 合作 社生 产灵 芝母种、原 种和 栽培 种。2 规范性 引用 文件 下列术 语和 定义 适用 于本 文件。2.1 灵芝 Ganoderma lucidum 灵芝（Ganoderma lucidum），别 名瑞芝、仙草，俗称“灵 芝草”，隶 属于 担子 菌纲（Basidiomycetes）、多孔菌 目（Polyporales）、灵芝 科（Ganodermataceae）、灵芝 属（Ganoderma）。2.2 菌种 spawn 菌丝体 生长 在适 宜基 质上 具结实 性的 菌丝 培养 物。分为母 种（一级 种）、原 种（二 级种）和 栽 培种（三级 种）三级。2.3 母种 stock culture 经组织 分离、孢 子分 离等 方式获 得到 的具 有结 实性 的菌丝 体纯 培养 物及 其继 代培养 物，以玻 璃试 管或培养 皿为 培养 容器 和使 用单位，也 称为 一级 种、试管种。2.4 原种 pre-culture spawn 由母种 移植、扩 大培 养而 成的菌 丝体 纯培 养物，也 称为二 级种。2.5 栽培种 spawn 由原种 移植、扩大 培养 而 成的菌 丝体 纯培 养物，也 称为三 级种。栽培 种只 能 用于扩 大到 栽培 出菇 袋或直接 出菇，不 可以 再次 扩大繁 殖菌 种。DB15/T 1626 2019 2 2.6 固体菌 种 solid spawn 以富含 木质 素、纤维 素和 半纤维 素或 淀粉 含量 高的 谷物粒 等天 然 有 机物 为主 要原料，添 加适 量的 有机氮 源 和无 机盐 类，具 一 定水分 含量 的培 养基 培养 的纯菌 丝体。是传 统食 用 菌生产 使用 菌种 状态，也 用于菌种 保存。2.7 液体菌 种 liquid spawn 培养基 营养 成份 与母 种相 同、不 加琼 脂的 液体 培养 基，通 过摇 瓶震 荡培 养或 深层发 酵技 术快 速获 得的大量 的纯 双核 菌丝 体，菌丝体 在液体 培 养基 中呈 絮状或 球状。液 体菌 种可 以作为 原种 或栽 培种 直 接 接种在固体 培 养袋 中，不能 进行菌 种保 存。3 菌种生 产要 求 3.1 人员 菌种 生 产所 需要 经过 专业 培训、掌握 滑子 菇 基 础知 识 及 灵芝 菌种 生产 技术 规程 要求的 技术 人员 和检验人员。3.2 环境 应选择 地势 高，通风 良好，空气 清新，水 源近，排 水通畅，交 通便 利的 场所。300m 之 内无 酿造 厂、集贸 市场、规模 养殖 的畜 禽舍、垃圾 和粪 便堆 积场，无 污水、废气、废渣、烟尘和粉 尘等 污染 源。3.3 设施 厂房要 求有各 自隔 离的摊 晒场、原材料 库、配料分 装库。配套有 配料 室、搅 拌室、装袋（瓶）室、灭菌室、冷 却室、接 种室、培养 室（通风 好，有纱 窗）、菌种 检测 室及 菌种 冷藏库 等各 环节 的设 施。冷却室、接种 室，培养 室都 要有离 子净 化设 施。3.4 设备 生产需 要粉 碎机、电 子秤、搅拌 机、装袋（瓶）机、高压 灭菌 锅或 常压 灭菌 锅、离 子净 化器、超 净工作台 或接 种箱、恒 温培 养箱、培养 架、摇床、液 体菌种 灌（30L 250L）、显微镜 等设备。3.5 容器 3.5.1 母种生 产容 器 试管选 用18mm180mm或者20mm200mm；培养 皿选 用直 径7cm 9cm 玻璃 培养 皿或 一次性 塑料 培养 皿。3.5.2 原种、栽培 种生 产容 器 3.5.2.1 固体菌 种 DB15/T 1626 2019 3 原 种 采用850ml 以 下、瓶 口直 径 4cm、耐126 高温 的透 明 瓶子，或 采用（12 17）cm（22 28）cm 的聚 丙烯 塑料 袋。栽培种 采用 同原 种要 求相 同的瓶 子，也可 采用（15 17）cm（33 35）cm 的 聚丙烯 塑料 袋。3.5.2.2 液体菌 种 三角瓶 液体 菌种 容器：采 用150ml 500ml 三角 瓶，带滤膜 的封 口膜。液体菌 种罐：采 用专 业厂 家生产 的液 体菌 种罐。3.6 培养原 料 硫酸镁、磷 酸二 氢钾、蛋 白胨、蔗糖、葡 糖糖、石 膏、琼 脂粉 等均 采用 分析 纯。马铃薯、麦 粒、谷粒、玉 米粒、柠条 粉、棉籽 壳、木屑、玉米 芯粉、豆 秸粉 要求无 霉变。4 母种生 产 4.1 生产流 程 见示例 图。图1 菌种生 产流 程示 例图 4.2 培养基 以下培 养基 任选 其一：PDA 改 良培 养基。豆饼 粉20g 加水 1200ml 煮沸 15min，滤 液定 容至 1000ml，加 入蛋 白胨 1g、酵母 粉1g、硫酸镁 0.5g、磷 酸二 氢钾 1g、葡萄 糖10g、蔗糖10g、琼脂 粉 8g 10g，pH 自然；新鲜无 病去 皮马 铃 薯 200g 切片加 水1200ml 煮沸 15min，滤 液定 容至 1000ml，加入蛋 白 胨1.6g、酵母 粉 1.6g、硫 酸 镁0.5g、磷酸 二氢 钾）1g、葡萄 糖10g、蔗糖10g、琼脂 粉8g 10g，pH 自然；麦粒 100g 加水1200ml 煮沸 15min，滤 液定 容至1000ml，加入 蛋白 胨 1.5g、酵 母 粉1.5g、硫酸 镁0.5g、磷酸 二氢 钾1g、葡萄糖 10g、蔗糖 10g、琼脂 粉 8g10g，pH 自 然；新鲜无 病去 皮红薯 200g 切 片加 水 1200ml 煮沸 20min，滤液 定容 至 1000ml，加 入蛋白 胨1.6g、酵母 粉 1.6g、加 入 硫酸 镁 0.5g、磷酸 二氢 钾 1g、葡 萄 糖 10g、蔗 糖 10g、琼脂 粉18g10g，pH 自然；PDA 培 养基。新鲜 无病 去皮 马铃 薯 200g 切 片加 水 1200ml 煮沸 20min，滤液 定容 至 1000ml，加入硫酸 镁0.5g、磷 酸二 氢 钾 1g、蔗糖 20g、琼脂粉8g10g，pH 自然。4.3 分装和 灭菌 DB15/T 1626 2019 4 母种培 养基 温度 降到90 即可分装 至 不同 容器。4.3.1 试管母 种制 作 4.3.1.1 分装 分装培养基至试 管1/4 处，用棉塞或硅胶塞 封闭试管口，每5支试管为1把，牛皮纸包棉塞，橡 皮筋扎紧，棉塞 向上 放置。棉 塞应采 用梳 棉，不能 使用 脱脂棉。4.3.1.2 灭菌 121124（0.11MPa 0.14MPa）保持25min。4.3.1.3 冷却 灭 菌 完毕 后 自然 降压，降温 至（655）左 右时 取出 试 管，在 空气 清洁 的 室内 摆 斜面，斜面 长度不超过 试管 长度 的2/3，自 然降温 凝固 后成 斜面。4.3.2 培养皿 母种 制作 4.3.2.1 灭菌 培养基 装入300ml500ml 三角瓶 至 刻度 的2/3 处，用 带滤膜 的封口 膜封口 后灭 菌。培 养皿用 报纸 包好，同 时放 入灭 菌锅 灭菌。在121124（0.11MPa 0.14MPa）保持25min。4.3.2.2 分装 灭菌完 毕后自 然降 压，降 温至70 5 时取 出三角 瓶和培 养皿放入 无菌 超净 工作台 或接种 箱内，将三角 瓶内 培养 基摇 匀 后 快速 均 匀倒 入 无 菌培 养皿 中，培 养基 占培 养皿 高度 的1/31/2。迅速 盖好 上盖。自然降 温凝 固后 制成 平板 培养基。4.4 检测 抽取3%5%的试 管和 培养 皿，在28 下培 养48h，无 微生物 长出 为灭 菌合 格。4.5 接种 在超净 工作台 或接种 箱内 接种，接种前 用紫外 灭菌 灯照射30min 后打开 风机20min，之 后用75%酒精进行表 面消 毒。接种的 菌块3mm 5mm，接 种在培 养皿 或试 管的 中部。培养 皿 需 用石 腊封口 膜 密封。接菌过 程 严 格执 行无 菌操 作，接 种后 及时 贴好 标签 并做好 记录。4.6 培养 温度控 制在23 26，空气湿 度在75%以下，通 风 避光培 养。4.7 母种检 查 母种接 种后 第3 天、第7 天 和菌丝 体长 满培 养基 后分 别逐个 进行 检验，挑出 未 活、污染 和生 长不 良的不合格 培养 物，拿到 准备 室及时 进行 淘汰 处理。表1 灵芝母 种感 官要 求 DB15/T 1626 2019 5 项目 要求 容器 完整、无损、洁净 棉塞或无棉盖体 干燥、整洁、松紧适度、能满足透气和过滤要求 培养基灌入量 为试管总容积的1/4，培养皿高 的1/3 1/2 菌种外观 菌丝生长量 长满斜面或平板 菌丝体特征 菌丝洁白、绒毛状、生长致密、均匀、健壮 菌丝体表面 均匀、舒展、平整 菌丝体分泌物 无 菌落边缘 整齐 杂菌菌落 无 斜面背面外观 培养基不干缩，无积水、颜色均匀、无暗斑、无色素 5 原种、栽培 种生 产 5.1 固体菌 种 5.1.1 培养基 粮食培 养基。谷 粒、麦 粒 或玉米 粒 90%，柠 条粉 或 棉籽壳、木 屑、玉米芯 粉、豆秸 粉 9%，石膏 1%，石灰 1%，水 分含 量（60 65）%，调 节 pH 至 7.0 7.5。组合培 养基：玉米芯39%+木屑 39%+麸皮 20%+石膏1%+石灰 1%、水分含 量（6065）%调节 pH 至7.0 7.5；棉籽 壳80%+麦麸 18%+石膏 1%+石灰1%、水分 含量（6065）%调节 pH 至 7.0 7.5；B.3 木屑 78%+麦麸 17%+豆 饼粉3%+石膏 1%+石灰 1%、水分含 量（6065）%调节 pH 至7.0 7.5；B.4 柠 条粉 78%+麦麸 17%+玉米粉 3%+石膏 1%+石灰 1%、水 分含 量（60 65）%调节 pH 至7.07.5；B.5 豆 秸粉 78%+麦麸 17%+玉米粉 3%+石膏 1%+石灰 1%、水 分含 量（60 65）%调节 pH 至7.07.5。5.1.2 装袋（瓶）培养基 的多 种组 成按 照比 例称量 干料 搅拌 均匀，边 加水边 混拌 均匀，含 水量60 2%。采用装 袋（瓶）机或 人工 进行装 袋（瓶），人工 装袋（瓶）需用 打孔 器在 袋口 处打孔，孔直 径1cm 1.5cm 深度 为8cm 12cm，无棉盖 体或 海绵 封口。5.1.3 灭菌 培养基 质装袋（瓶）后要 求在3h 之内使 菌种 袋表面 温度达 到100。灭 菌可 分 为高压 灭菌和 常压 灭菌。常压灭 菌：保持100 8 9h。高压灭 菌：组 合培 养基 维 持121 123（0.11MPa 0.13 MPa）2h；粮 食培 养 基维持121 123（0.11MPa 0.13MPa）2.5h。5.1.4 接种 DB15/T 1626 2019 6 原种、栽 培种 在超 净工 作 台或接 种箱内 接种，接 种 前 打开 紫外 灯照 射30min，接种时 用75%酒 精对 超净工作 台或 接种 箱进 行表 面擦拭 消毒。原种接 种：每个 原种 接入2cm 3cm 大 小母 种12块；栽培种 接种：每个 栽培种 接入原 种量不 得少 于15g。菌种都 应从容 器开 口处接 种，不 应打孔 多点 接种。要严格 按无菌 操作 接种，每批接 种应为 单一 品种，如中途 换品种 时采 用75%酒 精对超 净工作 台或 接种箱进 行表 面擦 拭消 毒。5.1.5 培养 温度控 制在23 26，空气湿 度在75%以下，通 风 避光培 养。5.1.6 检验 接种后 第7天、第10 天和菌 丝体长 满袋（瓶）后，逐 个全面 检验，挑出 未活、污染和 生长不 良及 破损的不 合格 菌种 袋（瓶），拿到 准备 室及 时进 行淘 汰处理。表2 灵芝原 种感 官要 求 项目 要求 容器 完整、无破损、洁净 棉塞或无棉盖体 干燥、整洁、松紧适度、能满足透气和滤菌要求 培养基上表面距瓶（袋）口的距离（50 5）mm 菌种外观 菌丝生长量 长满容器 菌丝体特征 菌丝体 白、生长旺健、整齐 培养物表面菌丝体 生长均匀、无高温抑制线 培养基及菌丝体 紧贴瓶壁、无干缩 菌丝分泌物 无、允许少量无色至棕黄色水珠 杂菌菌落 无 子实体原基 无 表3 灵芝栽 培种 感官 要求 项目 要求 容器 完整、无破损 棉塞或无棉盖体 干燥、整洁、松紧适度、能满足透气和滤菌要求 培养基上表面距瓶（袋）口的距离（505）mm 表 3（续）DB15/T 1626 2019 7 项目 要求 菌 种 外 观 菌丝生长量 长满容器 菌丝体特征 生长均匀、色泽一致、无角变、无高温抑制线 培养基及菌丝体 紧贴瓶壁、无干缩 菌丝分泌物 无 杂菌菌落 无 子实体原基 允许少量、出现原基种类5%5.1.7 贮存 原种和 栽培 种在0 4 下贮存，贮 存期 不超 过50d。贮存摆 放在 层架 或者 贮存 在筐内。5.2 液体菌 种生 产 5.2.1 培养基 以下培 养基 任选 其一：PDA 改 良培 养基。豆饼 粉20g 加水 1200ml 煮沸 15min，滤 液定 容至 1000ml，加 入蛋 白胨 1g、酵母 粉1g、硫酸镁 0.5g、磷 酸二 氢钾 1g、葡萄 糖10g、蔗糖10g，pH 自 然；新鲜无 病去 皮马 铃 薯 200g 切片加 水1200ml 煮沸 15min，滤 液定 容至 1000ml，加入蛋 白 胨1.6g、酵母 粉 1.6g、硫 酸 镁0.5g、磷酸 二氢 钾）1g、葡萄 糖10g、蔗糖10g，pH 自 然；麦粒 100g 加水1200ml 煮沸 15min，滤 液定 容至1000ml，加入 蛋白 胨 1.5g、酵 母 粉1.5g、硫酸 镁0.5g、磷酸 二氢 钾1g、葡萄糖 10g、蔗糖 10g，pH 自然；新鲜无 病去 皮红薯 200g 切 片加 水 1200ml 煮沸 20min，滤液 定容 至 1000ml，加 入蛋白 胨1.6g、酵 母粉 1.6g、加 入 硫酸 镁0.5g、磷酸 二氢 钾1g、葡萄 糖10g、蔗糖10g，pH 自然；PDA 培 养基。新鲜 无病 去皮 马铃 薯 200g 切 片加 水 1200ml 煮沸 20min，滤液 定容 至 1000ml，加入硫酸 镁0.5g、磷 酸二 氢 钾 1g、蔗糖 20g，pH 自然。5.2.2 三角瓶 液体 菌种 生产 5.2.2.1 装瓶 采用150ml 500ml 三 角瓶，培养 基添 加至 刻度 的2/3 处，用 带滤 膜的 封口 膜封 口后灭 菌。5.2.2.2 灭菌 121 122(0.11MPa 0.12MPa)保持25min 灭 菌。5.2.2.3 接种和 培养 接种量 是取2mm 3mm 大小 母种10 块12块 放进 液体 培养基 中，培 养温 度 在23 26，振荡 频率（搅拌速度）140 r/min 160 r/min 下振 荡培 养8d 10d。5.2.2.4 检验 DB15/T 1626 2019 8 液体菌 种接 种后 第3 天对 三 角瓶 逐 个进 行纯度 检 验，及时清 理未 活或 污染 的 三 角瓶。5.2.3 菌种 罐 液体 菌种 生产 5.2.3.1 装罐和 灭菌 填装培 养基至 液体 菌种罐2/3 处，按照液 体菌 种罐说 明书要 求，对 液体 菌种罐 和液体 培养基 灭菌，待液体 培养 基冷 却至30 以下时 进行 接种。5.2.3.2 接种与 培养 将 培 养 好 的 三 角 瓶 液 体 菌 种 接 入 到 液 体 菌 种 罐 中，接 种 量 为 培 养 基 总 体 积 的8%10%，培 养 温 度（252），搅 拌转 速150 r/min 160r/min，灌压0.04MPa，通 风量0.7N m3/h。培养 时间3d 5d。液体菌 种转 接不 得超 过3 次。5.2.4 检验 液体菌 种接种 后第3 天对罐 内培养 基 进行 纯度 检验，及时清 理未活 或污 染的罐 内培养 基后，对液 体菌种罐 高压 消毒。表4 灵芝液 体菌 种种 感官 要求 项目 要求 容器 完整、无破损、无裂纹 菌丝生长量 培养基 1/2 1/3 菌丝体特征 白色至透明块状、生长旺健 培养基 清澈、无杂色 杂菌 无杂菌 6 入库 检验合 格的 固体 菌种 应及 时入菌 种库，详细 记录 各 生产环 节，液 体菌 种生 产 应该随 用随 生产，不能进行入 库保 存。菌种库 温度 应该1 4，避 光，适当 通风 但应 该 对空气 进行 杀菌 处理。母 种在库 中贮 存时 间不 应长于50d，贮存 时间 超出50d 的母 种应 该进 行出 菇检 验 后再进 行后 续生 产。每隔20d 进 行一 次检 查，提 出破损、污 染、生产 异常 的菌种。7 留样 各级菌 种均应 应留 样，每 批次留 样3个（支），贮存 在14，贮存至 购买 者购买 后正常 生产 条件下出 第一 潮菇。_
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