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ICS 67.140.10 X 55 DB34 安徽省地方标准 DB 34/T 28902017 茶叶中主要品质成分快速测定-近红外光谱法 Method for determination of the major components in tea-Near infrared reflectance spectroscopy 文稿版次选择 2017-06-30发布 2017-07-30实施安徽省质量技术监督局发布 DB34/T 28902017 I 前言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。本标准由安徽农业大学茶树生物学与资源利用国家重点实验室提出。本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：安徽农业大学茶树生物学与资源利用国家重点实验室、江苏大学。本标准主要起草人：张正竹、宁井铭、宛晓春、李大祥、陈全胜、李露青。DB34/T 28902017 1 茶叶中主要品质成分快速测定-近红外光谱法 1 范围 本标准规定了茶叶中主要品质成分快速测定-近红外光谱法。本标准适用于六大茶类（绿茶、红茶、黑茶、乌龙茶、黄茶、白茶）。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 5009.3 食品安全国家标准 食品中水分的测定 GB/T 8302 茶 取样 GB/T 8303 茶 磨碎试样的制备及其干物质含量测定 GB/T 8305 茶 水浸出物测定 GB/T 8312 茶 咖啡碱测定 GB/T 8313 茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法 GB/T 8314 茶 游离氨基酸总量的测定 GB/T 23193 茶叶中茶氨酸的测定 高效液相色谱法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 相关系数 related coefficient,R 近红外光谱法测定值与经典法（现行国家标准分析方法）测定值的相关性，通常以定标样品相关系数以 R 表示，预测样品相关系数以 r 表示，用于考察样本的预测值和实测值之间的相关程度，R/r 值越接近于 1，说明预测值与标准值之间的相关程度越好，见计算公式（1）：niinii iy yy yr1212)()(1/R.(1)式中：yi 样品 i 的近红外光谱模型预测值；yi 样品 i 的标准值；DB34/T 28902017 2 y n 个样品标准值平均值；n 样品集样本总数。3.2 交叉验证均方根误差 root mean square error of cross validation,RMSECV 样品的近红外光谱预测值与标准方法测定值之间的标准差，表示定标模型调整后的准确度，一般用于评价某种建模方法的可行性及所建模型的预测能力，在模型训练过程中通过交互验证方法计算，见计算公式（2）：nnii iy y 12)(RMSECV.(2)式中：yi 训练集中样品 i 的标准值；yi 训练集中剔除样品 i 利用剩余样品建模后，样品 i 的近红外预测值；n 训练集样本数。3.3 预测均方根误差 root mean square error of prediction,RMSEP 模型对预测集样本预测的均方根误差，用于评价所建模型对外部样本的预测能力，预测均方根误差越小，表明模型对外部样品的预测能力越好；反之，其预测能力越差，见计算公式（3）：nnii iy y 12)(RMSEP.(3)式中：yi 预测集中样品 i 的标准值；yi 预测集中样品 i 的近红外预测值；n 预测集样本数。3.4 标准差 standard deviation,SD 标准差是对一组数据平均值分散程度的一种度量。标准差较小，表示这些数值较接近平均值，即测量精确度较高，见计算公式（4）：nniiiyy 12)(.(4)DB34/T 28902017 3 式中：yi 样品 i 的近红外光谱模型预测值；yi n 个样品近红外光谱模型预测值平均值；n 样品集样本总数。3.5 重复性 repeatability,SDr 测量数值集合的标准差，用于评价相同条件下，同一被测样品在短时间内多次制样、测量，所得结果的一致性，即重复性测量时的误差，利用标准差公式（4）计算。3.6 异常样品 outlier Sample 样品近红外光谱与定标样品差别过大，具体表现为样品近红外光谱的马哈拉诺比斯（Mahalanobis）距离（H 值）大于设定的阈值范围，则该样品被视为异常样品。4 原理 利用水分、茶多酚、儿茶素、咖啡碱和氨基酸等物质中含有的 C-H、N-H、O-H 等化学键的倍频或合频振动，以漫反射方式获得在近红外区的吸收光谱，用化学计量学方法建立茶样近红外光谱与其水分含量、茶多酚、儿茶素、咖啡碱、氨基酸和水浸出物含量之间的预测模型，实现用茶叶近红外光谱信息快速预测其水分含量、茶多酚、儿茶素、咖啡碱、游离氨基酸和水浸出物含量。5 仪器设备 5.1 近红外光谱仪 傅里叶变换近红外光谱分析仪，光谱范围为 7001400 nm。5.2 软件 适合 WINDOWS 和 Mac 操作系统，具有 NIR 光谱数据的收集、存储、预处理、建模和预测等功能。6 测定 按照附录A 的规定。6.1 测试前的准备 6.1.1 从待测茶叶样品中按 GB/T 8302 的方法取出一部分有代表性的样品。6.1.2 样品粉碎成粉末，粒度要求过 80 目筛，取 3 g样品，在 40 MPa 压强下压制成直径 20 mm 以上、厚度 5 mm 圆饼，要求表面光滑。DB34/T 28902017 4 6.1.3 扫描光谱前，先将仪器预热 30 min，保持仪器系统内部稳定；待预热完毕后，对仪器进行自检，查看仪器是否运行正常。6.1.4 在使用状态下，每 5 个小时扫描一次标准白板，保证光谱的准确性。6.1.5 在光谱采集过程中，每个样品采集 3 个不同位置的光谱，将三个位置的光谱平均值作为该样品的最终光谱。6.2 定标 按照附录B 的规定。6.2.1 定标样品收集 近红外光谱分析的准确性在一定程度上取决于定标工作，因此要选择有代表性的样品 100 个以上。符合近红外光谱仪按照 6.1.5 的方法，采集每个代表性样品的光谱值，存储在 5.2 的软件中。按照相应的标准方法：GB 5009.3、GB/T 8313、GB/T 8312、GB/T 8314、GB/T 8305，分别检测每个样本的水分含量、茶多酚、儿茶素、咖啡碱、氨基酸和水浸出物含量，作为建模的参考值，存储在 5.2的软件中。6.2.2 模型的建立与验证 利用所有定标样品的光谱值和所对应检测指标的标准值，基于软件中自带的偏最小二乘（Partial Least Squares,PLS）方法建立模型，模型建立的过程中需对光谱预处理方法、模型的因子数和光谱范围进行优化；建立好的模型存储在软件中，可随时调用。评价模型的预测可靠性（验证），使用“交叉检验”和“外部检验”（交叉检验中建模和检验使用相同的样品系列，外部检验需使用两个样品系列）。PLS 模型的评判指标主要包括：相关系数(related coefficient,R)，交叉验证均方根误差(root mean square error of cross validation,RMSECV)和预测均方根误差(root mean square error of prediction,RMSEP)。6.2.3 定标模型的升级 定标模型升级的目的是为了使该模型在近红外光谱仪器上能适应于待测样品。每年选择不同季节生产的样品，采用标准理化检测方法测定其内含成分含量后加入到已建立的定标模型中，完善模型信息结构，获得升级的定标模型。6.3 对未知样品的测定 待测定的茶样按照 6.1.2 处理方法，经过粉碎、过筛和压饼后，平放在仪器的扫描窗口上，确保能完全遮盖窗口。样品放置好后，开始扫描光谱，根据样品的光谱数据，仪器会给出相应的样品中各品质成分含量。假如样品为异常样品，仪器显示数值为 99.99。6.4 异常样品的分类和处理 异常样品可分为“好”、“坏”两类，“好”的异常样品加入定标模型后可增加该模型的分析能力，而“坏”的异常样品加入定标模型后，只能降低分析的准确度。“好”、“坏”异常样品的判别标准有二：一是 H 值，阈值范围一般设为 5，通常“好”的异常样品 H 值 5，通常“坏”的异常样品 H 值5；二是 RMSECV，通常“好”的异常样品加入定标模型后，RMSECV 不会显著增加，而“坏”的异常样DB34/T 28902017 5 品加入定标模型后，RMSECV 将显著增加。近红外光谱分析中发现异常样品后，要用标准理化检测方法对该样品进行分析，同时对该异常样品类型进行确定，属于“好”异常样品则保留，并加入到定标模型中，对定标模型进行升级；属于“坏”异常样品则放弃。7 分析的允许误差 分析的允许误差见表1。表1 允许误差表 样品中组分 含量（）重复性(SDr)预测均方根误差(RMSEP)水分 10 0.60 0.80 6,10 0.50 0.70 6 0.30 0.40 茶多酚 25 1.40 1.9 10,25 1.25 1.75 10 0.50 0.70 儿茶素 15 0.90 1.10 7,15 0.75 1.00 7 0.35 0.50 咖啡碱 4 0.40 0.40 2,4 0.20 0.30 2 0.10 0.20 游离氨基酸 5 0.4 0.50 1,5 0.25 0.40 1 0.1 0.10 水浸出物 40 2.20 3.00 20,40 2.00 2.80 20 1.00 1.40 8 定标模型的验证及评价 8.1 验证的基本要求 8.1.1 下列情况之一，需要验证定标模型：a)定标模型首次使用时，或定标模型更新后，或更换仪器时；b)样品来源发生重大改变时；c)仪器维修或者更换光源配件后；d)每年至少需要验证 2 次。8.1.2 验证集样品应覆盖样品的产地、品种、加工季节、不同等级等，然后从中挑选出具有代表性的样品，对定标集进行验证。验证集样品的范围应在定标集模型的含量范围内，数量不少于 30个。DB34/T 28902017 6 8.1.3 样品组分的标准值，应由有资质的 3 个实验室，按照规定的标准方法进行测定并统计确定。样品组分化学分析应与近红外光谱分析同期进行。8.1.4 验证测试时的温度应与定标模型建立时的温度相一致。8.2 验证的内容及评价 8.2.1 准确性验证 采用验证集样品对定标模型的准确性进行验证时，验证的预测均方根误差（RMSEP）应符合 6.2.1中的规定。不符合要求的，不能通过验证，应该查明原因，否则，不能用该仪器进行预测。8.2.2 重复性验证 采用验证集样品对定标模型的重复性进行验证。选择组分含量高、中、低的 3 个验证集样品，分别测定 10 次，各测定结果的重复性应符合表1 的要求。不符合要求的，不能通过验证，应该查明原因，重新进行验证，直至符合要求。9 仪器及模型建档 包括：a)定标模型的名称和编号；b)定标模型组分的浓度范围；c)定标模型使用的温度允许范围；d)异常样品的类型、品种、界限和处理的有关信息；e)验证样品类型；f)验证样品个数；g)验证样品采集及预处理方法，见附录 A；h)验证样品的组分浓度范围；i)验证样品测试浓度范围；j)测定化学值的标准方法；k)定标模型验证评价（RMSEP和 R），见附录 B；l)验证单位；m)验证日期。DB34/T 28902017 7 A A 附 录 A（规范性附录）验证样品制备 A.1 应分产地、茶类，所采集的样品含量应尽量均匀分布，且能代表近红外光谱定标模型成分含量所覆盖的范围。A.2 样品采集后，需要粉碎成粉末，粒度要求过 80 目筛，混和均匀后，取 3 g 在 40 MPa 压强下压制成直径 20 mm 以上、厚度 5 mm 圆饼，要求表面光滑。A.3 仪器预热后，扫描样品近红外光谱；对同批次样品粉碎后，使用牢固的包装密封物保存样品，并放在装有有效干燥剂的干燥器中盛放。A.4 根据以下标准方法测定样品水分、茶多酚、儿茶素、咖啡碱、游离氨基酸和水浸出物含量。GB 5009.3 食品安全国家标准 食品中水分的测定 GB/T 8302 茶 取样 GB/T 8303 茶 磨碎试样的制备及其干物质含量测定 GB/T 8305 茶 水浸出物测定 GB/T 8312 茶 咖啡碱测定 GB/T 8313 茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法 GB/T 8314 茶 游离氨基酸总量的测定 GB/T 23193 茶叶中茶氨酸的测定 高效液相色谱法 A.5 测定结果应汇总统一处理，计算验证样品组分含量的标准值。DB34/T 28902017 8 B B 附 录 B（规范性附录）定标的总则和程序 B.1 样品的选择 参与定标的样品应具有代表性，即需涵盖将来所要分析样品的特性。创建一个新的校正模型，至少需要收集 100 个样品。样品过少，将导致定标模型的欠拟合性；样品过多，将导致模型的过拟合性。B.2 稳定样品组 为了使定标模型具有较好的稳定性，即其预测性性能不受仪器本身波动和样品的温度发生变化的影响，在定标中应加上温度发生变化的样品和仪器发生变化的样品。B.3 定标样品选择的方法 对定标样品的选择应使用主成分分析法(PCA)。根据样品在 score1 vs.score2 空间位置的不同选择有代表性的样品，去除空间位置非常接近的样品。B.4 定标样品真实值的测定 对于定标样品需要知道其水分、茶多酚、儿茶素、咖啡碱、游离氨基酸和水浸出物含量的真值，在实际测量中，通常以标准方法 GB 5009.3、GB/T 8313、GB/T 8312、GB/T 8314、GB/T 23193、GB/T 8305的测定值代替。B.5 定标方法 偏最小二乘法回归法(partial least square regression,PLSR)，该方法在确定独立变量时，不仅考虑光谱的信息(X 变量)，还考虑化学分析值(Y 变量)。该方法是目前近红外光谱分析上应用最多的回归方法，在制定本标准时应用 PLSR。B.6 B.6 定标模型更新 定标是一个由小样本估计整体的计量过程，因此定标模型预测能力的高低取决于定标样品的代表性。由于预测样品的不确定性，因此，很难一下选择到合适的定标样品。所以，在实际分析工作中，通常用动态定标模型办法来解决这个问题。DB34/T 28902017 9 动态定标模型办法就是在日常分析中分析选择异常样品，定期进行定标模型的升级，可概括为以下步骤：a)定标设计；b)分析测定；c)定标运算；d)实际预测；e)异常数据检查；f)再定标设计；g)再分析测定；h)再定标运算。_
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