化妆品中维生素D2和维生素D3测定 高效液相色谱法DB37／T 3309-2018.pdf

ICS 71.100.70 Y42 DB37 山东省 地 方 标 准 DB 37/T 3309 2018 化妆品中维生素 D2 和维生素D3 测定 高效液相色谱法 Determination of Vitamin D2 and Vitamin D3 in Cosmetic by High Performance Liquid Chromatography 2018-06-12 发布 2018-07-12 实施 山东省质量技术监督局 发布 DB37/T 3309 2018 I 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009 给出 的规则起 草。本标准由山 东省质量 技术监督 局提出。本标准由山 东化工标 准化技术 委员会归 口。本标准起草 单位：山 东省产品 质量检验 研究院、山东福瑞 达生物工 程有限公 司。本标准主要 起草人：朱海荣、焦毅、商 姗姗、田 静、刘金 凤、王灵 玺、王东 岳、刘鹏 飞、赵丽芳、周莉莉、姜 金华、张 娟、杨素 珍。DB37/T 3309 2018 1 化妆品中维生素 D2 和维生素 D3 测定 高效液相色谱法 1 范围 本标准规定 了化妆品 中维生素D2、维生 素D3的高 效液相色 谱法。本标准适用 于化妆品 中维生 素D2、维 生素D3 的检测。本方法取 样量为0.5 g 时，维生素D2 检出浓度为3.6 mg/kg，最低定 量浓度为10 mg/kg。维生素D3 检出浓 度为1.8 mg/kg，最低定量 浓 度为5 mg/kg。2 规范性引用 文件 下列文件对 于本文件 的应用是 必不可少 的。凡是注 日期的引 用文件，仅所注 日 期的版本 适 用于本文件。凡是不 注日期的 引用文件，其最新 版本（包 括所有的 修改单）适用于本 文件。GB/T 6682 分析实验 室用水规 格和试验 方法 3 方法提要 3.1 维生素 D2 和维生素 D3 在 265 nm 处 有紫外吸 收，可 用反相高 效液相色 谱法分离，并根 据 保留时间和紫外光谱 图定性，外标法定 量。3.2 试剂和溶液 除另有说 明外，所 用试剂均 为色谱纯，水为 GB/T 6682 规定的一 级水。4 试剂和材料 4.1 甲醇。4.2 乙腈。4.3 维生素 D2：纯度99.0%。4.4 维生素 D3：纯度99.0%。4.5 混合标准储 备溶液：分别准确 称取维生素 D2 0.1000 g 及维 生素 D3 0.2000 g，移入 100 mL 容量瓶中，用甲醇（4.1）溶 解并定容 至刻度，摇匀，作 为标准储 备溶液。避光保持，保存期 不 超过 2 周。5 仪器与设备 5.1 高效液相色 谱仪：紫 外或二极 管阵列检 测器。5.2 紫外分光光 度计。5.3 超声波清洗 器。5.4 分析天平：感量 0.0001 g。5.5 有机相微孔 滤膜：0.45 m。6 分析步骤 DB37/T 3309 2018 2 6.1 样品预处理 称取样品约0.5 g（精 确至0.0001 g）于10 mL具塞 比色管中，用流动 相定容至 刻度，摇 匀，超声提取30 min。经0.45 m 有机相 微孔 滤膜 过滤，滤 液作为待 测样液。6.2 色谱参考条 件 6.2.1 色谱柱：C18 柱，250 mm 4.6 mm，5 m。6.2.2 检测器：二 极管阵列 检测器。6.2.3 检测波长：265 nm。6.2.4 流动相：甲 醇+乙腈=90+10（HPLC 分析前，经 0.45 m 滤膜过 滤及真空 脱气）。6.2.5 流速：1.0 mL/min。6.2.6 进样量：10 L。6.2.7 柱温：室温。6.2.8 其它能够达 到同等分 离效果的 色谱条件 均可使用。6.3 标准曲线的 制备 6.3.1 纯度校正 由于维生素D2 和维生素D3 对光不稳 定，因 此在配置 标准溶液 之前需用 紫外分光 光度法进 行 纯度校正，方法如下：维 生素D2 和维 生素D3 在263 nm 波长处有 最大紫外 吸收，而 乙醇在该 波长无吸 收。95%乙醇溶 液中，质量分数 为1%的维 生素D2 溶液 的吸光系 数1%1cm 为460，质量分 数为1%的 维生素D3 溶 液的吸光 系数1%1cm为485，吸光 系数相当 于吸光度/浓度，因 此通过测 定吸光度 可得出所 配置溶液 的准确浓 度，进而校正 纯度。维生素D2 和维生素D3 的纯度按 照式（1）计算。L CAcm%1100P.(1)式中：P 维生素D2、维生素D3 的纯度，%；A 维生素D2、维生素D3 的吸光度，单位为 毫克每升（mg/L）；C 维生素D2、维生素D3 的质量分 数，%；L 比色皿 的光径，单位为厘 米（cm）；%1cm 维生素D2、维生素D3 的吸光系 数。6.3.2 标准曲线 的 绘制 分别准确 移 取一定量 维生素D2 和 维生素D3 的 标准 储备液（4.5），用流 动相将标 准工作溶 液 中稀释成一系列浓度 的标准溶 液，其 中标准溶 液中维生 素D2 的浓度 分别为200 mg/L、100 mg/L、80 mg/L、50 mg/L、20 mg/L、10 mg/L，标准溶液 中维生素D3 的浓度分 别为400 mg/L、200 mg/L、160 mg/L、100 mg/L、40 mg/L、20 mg/L。按 照浓度由 低到高的 顺序 依据 色谱条件（6.2）分 别测定，以 标准工作 溶 液 浓度为横 坐标，相应 色 谱峰峰面 积为纵坐 标，分别 维生素D2、维生素D3 绘制标准 工作曲线。标准物 质 色谱图参见 附录A，标准物 质 紫外吸 收光谱图 参见附录B。6.4 试样 测定 DB37/T 3309 2018 3 取预处理后 的待测液（6.1），按照色谱 条件（6.2）进行 测定，记 录色谱峰 的保留时 间 和峰面积，由色 谱峰 的峰 面积 可从 标 准曲 线上 求出 维生 素D2 和维生 素D3 的 浓度。样 品 溶液 中维 生素D2 和 维 生素D3 的响应值均应 在仪器测 定的线性 范围之内，维生素D2 和 维生素D3 含 量高的试 样可取适 量 待测 液（6.1）用 流动相 稀释后 进行测定。6.5 平行实验 按以上步骤 对同一试 样进行平 行试验。6.6 空白试验 除不加样品 外，采用 完全相同 的步骤进 行平行测 定。6.7 分析结果表 述 维生素D2、维 生素D3 的含 量 按 式（2）计 算，计算 结果应扣 除空白值：mV c c)(0（2）式中：样 品中维生 素D2、维生 素D3 的质量 浓度，单位 为毫克 每千克（mg/kg）；c 标准曲 线查得维 生素D2、维 生素D3 的浓 度，单位 为毫克每 升（mg/L）；c0 根据标 准曲线得 到空白样 品中 维生 素D2、维生 素D3 的浓度，单位为 毫克每升（mg/L）；V 样品 的 定容体积，单位为 毫 升（mL）；m 样品质 量，单位 为克（g）。7 允许差 在重复性条 件下获得 的两次独 立测试结 果的绝对 差值不得 超过算术 平均值的 10%。DB37/T 3309 2018 4 A A 附 录 A（资料性附 录）标准物质液 相色谱图 AU0.0000.0050.0100.0150.020分钟2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00维生素D2-9.568维生素D3-10.168 图A.1 维生素 D2、D3 标准物 质液相色 谱图 DB37/T 3309 2018 5 B B 附 录 B（资料性附 录）标准物质紫 外吸收光 谱图 图B.1 维生素 B2、B3 标准物 质紫外吸 收光谱图 _