食用菌菌种真实性鉴定 RAMP法DB22／T 2083-2014.pdf

ICS 65.020 B 61 DB22 吉林省 地方标准 DB 22/T 2083 2014 食用菌菌种真实性鉴定 RAMP法 Verification of genuineness for edible mushroom spawn RAMP 2014-05-04发布 2014-06-01实施 吉林省质量技术监督局 发布 DB22/T 2083 2014 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009和 GB/T 20001.4-2001 给出的规则起草。本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由吉林省农业委员会提出并归口。本标准起草单位：吉林农业大学。本标准主要起草人：宋慧、刘晓龙、金周雨、汤海峰、宗立立、李雨婷、王健、谭旭华、李艳丽。DB22/T 2083 2014 1 食用菌菌种真实性鉴定 RAMP法 1 范围 本标准规定了利用 RAMP技术鉴定食用菌菌种真实性的分 析步骤、结果记录、分 析 鉴定的 方法。本标准 适 用 于猴头 菌（Hericium erinaceus）、小刺猴头 菌（Hericium caput-medusae）、珊瑚状猴头 菌（Hericium coralloidesPers）、黑木耳（Auricularia auricular）和 光帽鳞伞（Pholiota nameko）食用菌菌种真实性的鉴定。2 规范性引用文件 下列 文件 对于 本文件的 应 用 是必 不可 少 的。凡是注日期 的 引 用文件，仅所注日期 的 版 本 适 用 于 本文 件。凡是 不 注日期 的 引 用文件，其最新版 本（包括所有 的 修改 单）适 用 于 本文件。GB/T 6682 分 析 实 验室 用 水 规 格 和 试验方法 GB/T 12728 食用菌术 语 3 术语和定义 GB/T 12728 界 定的 以 及 下列 术 语 和定 义适 用 于 本文件。3.1 随机扩增微卫星 DNA多态性标记 Random Amplified Microsatellite Polymorphism（RAMP）是以 1条与微卫星序列互补 的 SSR引物 和 1条 RAPD随 机 引物相组合，对基因组中 的 微卫星序列与 随 机 引物互补序列之间 的 DNA片段进行随 机 扩增 的技术。3.2 菌种真实性 Verification of Spawn 供检 菌种 与对 照菌种的 符合 性 4 RAMP标记原理 采 用 RAMP标 记扩增基因组中微卫星序列与随 机 引物互补序列之间 的 DNA片段，通过比较试样与对 照 指纹图谱，从而 对 菌种 进行 鉴定。5 仪器设备及试剂 见附 录 A。6 溶液配制 DB22/T 2083 2014 2 见附 录 B。7 分析步骤 7.1 菌丝培养 7.1.1 培养基的制备 称取去皮马铃薯 200.0 g，制备成均匀碎块（约 1cm3），加蒸馏 水 1000 mL，煮沸 30 min，滤除固体 残渣，在马铃薯汁液 中 加入葡萄糖 20.0 g，硫酸镁 0.5 g，磷酸二氢钾 0.46 g，磷酸氢二钾 1.0 g，琼脂 18.0 g，加热使 其 充 分 溶解，定容 至 1000 mL，pH自然，装入 试 管，塞好 试 管塞。121-126，高压灭 菌 30 min，摆成斜面冷却后使 用。7.1.2 接种 将 供检 菌 株 与对 照菌 株在 相 同 条 件 下 培养，培养量 可 供 做 3个平 行 鉴定 试验。将待 供检 菌 株 与对 照菌 株在无 菌 条 件 下，切取（3 5）mm（3 5）mm大 小 一块母 种，迅速转移至 试 管斜面培养 基中 央 位 置，每个 菌 株接 种 20支 30支 试 管。7.1.3 恒温培养 将接 种 后 的 试 管置恒温培养箱 中，分别 在 25 条 件 下 避 光 培养 黑木耳 9 d 12 d，猴头 菌、小刺猴 头 菌、珊瑚状猴头 菌 培养 12 d 15 d；在 20 条 件 下 避 光 培养 光帽鳞伞 15 d 20 d。7.2 DNA提取 7.2.1 称取 0.1 g的菌 丝 置 于 无 菌 研钵 中，在液 氮 中 充 分 研磨 成 粉末；7.2.2 将 菌 丝粉末 迅速转移至 1.5 mL离心 管 中，加入 600 L的 65 预 热 的 CTAB DNA提 取 缓冲 液，置 于 65 水 浴 45 60 min，每 5 min 15 min颠倒混 匀；7.2.3 加入 等 体 积苯酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)抽 提 10 min，颠倒混 匀，4，12000 rpm离心 5 min；7.2.4 取 上清 加 等 体 积氯仿-异戊醇（24:1）抽 提 10 min，颠倒混 匀，4，12000 rpm离心 5 min，重复 7.2.4抽 提 1次；7.2.5 加 等 体 积异丙醇-20 充 分 沉淀；7.2.6 4，5000 rpm离心 10 min，弃上清；7.2.7 加 500 L的 70%乙醇洗涤沉淀 2次，室 温 干燥，加 40 L的 TE缓冲 液（pH 8.0）溶解；7.2.8 加入 10 mg/mL 的 RNase 溶液至 终浓度达 50 g/mL，去除 RNA，37 水 浴 1 h；7.2.9 重复操作 7.2.3 7.2.5，加入 100 L TE缓冲 液（pH 8.0），使 DNA充 分 溶解，并 置 于 4 冰箱 中 保存 备 用 注：长 期 保存 应采 用-20；多次测 定 需 分 装 保存，每 次 使 用 后 不 再重 新 冻存。7.3 DNA纯度检测 7.3.1 电泳检测 取 1%琼脂糖溶液 40 mL加入 4 L的 溴化乙锭，缓慢倒 入 凝胶托盘 中 冷却，避 免 出 现气泡，插 入梳子，待 胶 体 凝 固后，缓慢拔 出 梳子，将 凝胶托盘 置 于 装 有 1 TAE缓冲 液 的 水 平 电泳槽 中；在 凝胶点 样 孔 中 加入 5 L 菌 株 DNA提 取液 与 2 L的 6 Loading buffer的 混 合 液体，用 5 L的 Hind Marker作为参 照；采 用 100 V恒压 电泳，待 溴酚蓝前沿 指 示剂 移 动到距凝胶前沿 0.5 cm 1 cm处，停止电泳DB22/T 2083 2014 3（约 1 h）；在 凝胶 成 像系统 中 观察 并照 相；电泳 条 带 应 呈 现 单 一 清 晰 状 态，否 则 重 新 提 取 DNA。7.3.2 紫外检测 取 3 L DNA提 取液，用 无 菌 水 稀释 至一 定 倍数，混 匀后，加入 石英 比 色皿 中，加入量 为 比 色皿 体积 的 3/4，并 以 无 菌 水 或 TE缓冲 液 为 空白 对 照，用 紫外-可 见 分 光光 度 计 分别 在 260 nm和 280 nm下 测 量 其OD值，计算 OD260/OD280比 值，如 果 该 比 值 在 1.61.8之间，可 以进行 PCR反 应，否 则 重 新 提 取 DNA。待 测 样 品含 量（g/mL）=OD260值 稀释倍数 50 7.4 PCR扩增 7.4.1 RAMP引物及其使用 由 4条 SSR引物 和 10条 RAPD引物组 成 40对 核 心 引物。使 用 时首先选 用 5对 参 见附 录 C（按菌种分 类 引物）。如 果 没 有 得 到 好 的 结果，则 选 用 其 他 组合。7.4.2 PCR反应体系 25 L的 反 应 体 积，含 dd H2O为 3.25 L，10 PCR 缓冲 液 为 2.50 L，2.5 mmol/L dNTPs为 2.00 L，10 mol/L Primer1为 1.00 L，10 mol/L Primer2为 1.00 L，5 U/L Taq DNA聚 合 酶 为 0.25 L，5 ng/L DNA模板 为 15.00 L。7.4.3 PCR反应程 序 设 置 空白 对 照。94 预 变 性 2 min，1个 循环；94 变 性 1min，45 退火 1min，72 延伸 2min，共 45个 循环；72 延伸 10 min，4 保存。7.5 PCR产 物电泳检测 参 见 7.3.1方法。配 制 2%琼脂糖 凝胶，在 点 样 孔 中 加入 5 L的 菌 株 PCR产 物与 2 L的 6 Loading buffer的 混 合 液体，取 DL2000 Marker和 150 bp Marker各 3 L混 合 后 作为参 照。8 结果判 定 电泳 结 束，将 凝胶 置 于 凝胶 成 像 仪或紫外透射仪 观察，照 相 保 留 实 验结果。如 果 三 个平 行结果 一 致，实 验结果 可 以 使 用。供检 菌 株 与对 照菌 株 差 异 明显，判 定 供检 菌 株 与对 照菌 株 不 属 于 同一 菌种 或 同一 品 种，如只 出 现 一 对引物 差 异，则 判 定 为 近似 菌种 或近似品 种。供检 菌 株 与对 照菌 株 之间 的 谱 带未 检 测 出 差 异，再 选 定 5个 引物 做 进 一 步验 证 试验。必 要 时 可 增 加 其 他 方法 佐证。DB22/T 2083 2014 4 A A 附 录 A（规范性 附录）主要 仪器设备及试剂 A.1 主要 仪器设备 A.1.1 PCR扩增 仪；A.1.2 紫外-可 见 分 光光 度 计；A.1.3 凝胶 成 像系统 或紫外透射仪；A.1.4 冷 冻离心 机（能 离心 0.2 1.5 mL离心 管，转速在 1 104 rpm以 上）；A.1.5 高压灭 菌 装置（可 以 达到 温 度 121.3，压 力 0.15 MPa）；A.1.6 超净工 作 台；A.1.7 分 析 天 平（感 量 0.0001 g）；A.1.8 微 量移液 器：规 格 分别 为 10 mL、20 mL、100 mL、200 mL、1000 mL，连续 可 调；A.1.9 酸 度 计；A.1.10 恒温培养箱；A.1.11 冰 箱：最 低 温 度-20；A.1.12 水 浴 锅或 金 属 浴：控 温 精 度 1 A.1.13 电泳 仪（具 有 稳流 4 400 mA连续 可 调 和 稳 压 5 500 V连续 可 调）；A.1.14 水 平 电泳槽 及 配套 的 制 胶 附 件；A.1.15 照 相 系统。A.2 主要 试剂 A.2.1 十六烷 基 三 乙 基 溴化 铵（CTAB）；A.2.2 聚 乙 烯吡咯烷酮(PVP-40)A.2.3 溴酚蓝 A.2.4 乙 二 胺四 乙 酸二 钠（EDTA-Na2 2H2O）；A.2.5 三 羟甲 基 氨 基 甲 烷（Tris-base）；A.2.6-巯 基 乙醇 A.2.7 苯酚 A.2.8 三 氯 甲 烷；A.2.9 异丙醇：（2-丙醇;二 甲 基 甲 醇;C3H8O；CAS RN:67-63-0）A.2.10 异戊醇；A.2.11 盐 酸；A.2.12 氢 氧 化 钠（NaOH）；A.2.13 氯化 钠；A.2.14 10 Buffer缓冲 液：含 Mg2+25 mmol/L；A.2.15 四 种 脱氧 核 苷 三 磷酸：dATP、dTTP、dGTP、dCTP（10 mmol/L each）；A.2.16 Taq DNA聚 合 酶：2 U/mL；A.2.17 琼脂糖；DB22/T 2083 2014 5 A.2.18 DNA分 子 量 标准：DL2000；A.2.19 核 酸 染 色 剂；按 说 明 使 用。（警告 使 用本 试 剂 的人员 应有 正 规实 验室 的 工 作 经 验。本标准 并 未 指 出 所有 可能的 安全问题。使 用 者 有 责任 采 取 适 当 的 安全 和健 康措施，并 保 证 符合 国家 有 关 法 规规定的 条 件。）A.2.20 甲叉双 丙 烯 酰胺（bisacrylamide）；A.2.21 丙 烯 酰胺（acrylamide）；A.2.22 无 水 乙醇；A.2.23 四甲 基 乙 二 胺（TEMED）；A.2.24 过 硫酸 铵（APS）；A.2.25 冰 醋 酸；A.2.26 DNA分 子 量 标准 DB22/T 2083 2014 6 B B 附 录 B（规范性 附录）试剂的配制 除 另 有 说 明外，在 分 析中仅 使 用 确认 为 分 析 纯 的 试 剂 和 GB/T 6682规定的 一 级 水。B.1 溴酚蓝 前 沿指示 剂 加 1g水 溶 性 钠型 溴酚蓝 于 100ml水中，搅拌 或 涡旋 混 合 直 到 完全 溶解（溴酚蓝 其 钠盐易 溶解在 水 里）。B.2 1 mol/L Tris-HCl（pH 8.0）溶液 称取 Tris 121.1 g，加去 离子 水 溶解，冷却至 室 温后 用 浓 HCl溶液 调 节 溶液 的 pH至 8.0(约 42 mL)，定容 至 1000 mL，高压灭 菌。B.3 10 mol/L 氢氧化钠 溶液 称取氢 氧 化 钠 80 g，用 去 离子 水 溶解后，定容 至 200 mL。B.4 0.5 mol/L乙二胺四乙酸（pH 8.0）溶液 称取二 水 乙 二 胺四 乙 酸二 钠 186.1 g，加去 离子 水 700 mL完全 溶解（加热）后，冷却至 室 温，用 10 mol/L 氢 氧 化 钠 溶液 调 pH值 至 8.0，加去 离子 水 定容 至 1000 mL，高压灭 菌。B.5 CTAB DNA提取 缓冲 液 1 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)10 mL，0.5 mol/L EDTA(pH 8.0)4 mL，5 mol/L NaCl 56 mL,1-2g CTAB，1 g PVP-40，65 水 浴 溶解，定容 至 100 mL，高压灭 菌。使 用 前 加入 0.1%的-巯 基 乙醇。B.6 TE缓冲 液（pH 8.0）量取 1 mol/L Tris-HCl（pH 8.0）溶液 10 mL和 0.5 mol/L 乙 二 胺四 乙 酸（pH 8.0）溶液 2 mL，加水 定容 至 1000 mL，分 装高压灭 菌。B.7 50 TAE缓冲 液 称取 Tris 242.2 g，量取 冰 醋 酸 57.2 mL，加 水 溶解后，再 加入 0.5 mol/L乙 二 胺四 乙 酸（pH 8.0）溶液 100 mL，加 水 定容 至 1000 mL。使 用 时稀释 50倍。B.8 1%琼脂糖 溶液 DB22/T 2083 2014 7 称取 0.4 g琼脂糖 于 三 角瓶 中，加入 40 mL的 1 TAE缓冲 液，微 波炉 加热溶解。B.9 70%乙醇 溶液 取 70 mL无 水 乙醇，加 水 定容 至 100 mL。DB22/T 2083 2014 8 C C 附 录 C（资料 性 附录）分析用 DNA引物 参照 引物对 表 中相对应 的 核 心 引物对（一）为 首选 引物。表 C.1 黑木耳核心 引物 对（一）编号 类 型 核 苷 酸 序列 编号 类 型 核 苷 酸 序列 I2 SSR 5-GTTGTGTGTG-3 S8 RAPD 5-GTCCACACGG-3 I3 SSR 5-GTCACACACA-3 S8 RAPD 5-GTCCACACGG-3 I4 SSR 5-GCCACACACA-3 S1 RAPD 5-GTGACATGCC-3 I4 SSR 5-GCCACACACA-3 S5 RAPD 5-ACGCACAACC-3 I4 SSR 5-GCCACACACA-3 S8 RAPD 5-GTCCACACGG-3 表 C.2 黑木耳核心 引物 对（二）编号 类 型 核 苷 酸 序列 编号 类 型 核 苷 酸 序列 I1 SSR 5-GCTGTGTGTG-3 S2 RAPD 5-TTGGCACGGG-3 I1 SSR 5-GCTGTGTGTG-3 S5 RAPD 5-ACGCACAACC-3 I3 SSR 5-GTCACACACA-3 S1 RAPD 5-GTGACATGCC-3 I3 SSR 5-GTCACACACA-3 S5 RAPD 5-ACGCACAACC-3 I4 SSR 5-GCCACACACA-3 S2 RAPD 5-TTGGCACGGG-3 I4 SSR 5-GCCACACACA-3 S6 RAPD 5-CAGCACCCAC-3 表 C.3 光帽鳞伞核心 引物 对（一）编号 类 型 核 苷 酸 序列 编号 类 型 核 苷 酸 序列 I3 SSR 5-GTCACACACA-3 S6 RAPD 5-CAGCACCCAC-3 I4 SSR 5-GCCACACACA-3 S1 RAPD 5-GTGACATGCC-3 I4 SSR 5-GCCACACACA-3 S3 RAPD 5-GGTGACGCAG-3 I4 SSR 5-GCCACACACA-3 S5 RAPD 5-ACGCACAACC-3 I4 SSR 5-GCCACACACA-3 S8 RAPD 5-GTCCACACGG-3 DB22/T 2083 2014 9 表 C.4 光帽鳞伞核心 引物 对（二）编号 类 型 核 苷 酸 序列 编号 类 型 核 苷 酸 序列 I1 SSR 5-GCTGTGTGTG-3 S9 RAPD 5-CTGCTGGGAC-3 I2 SSR 5-GTTGTGTGTG-3 S10 RAPD 5-AGATGCAGCC-3 I3 SSR 5-GTCACACACA-3 S3 RAPD 5-GGTGACGCAG-3 I3 SSR 5-GTCACACACA-3 S7 RAPD 5-CCAGATGCAC-3 I3 SSR 5-GTCACACACA-3 S8 RAPD 5-GTCCACACGG-3 I4 SSR 5-GCCACACACA-3 S2 RAPD 5-TTGGCACGGG-3 I4 SSR 5-GCCACACACA-3 S4 RAPD 5-GTCGCCGTCA-3 I4 SSR 5-GCCACACACA-3 S6 RAPD 5-CAGCACCCAC-3 I4 SSR 5-GCCACACACA-3 S9 RAPD 5-CTGCTGGGAC-3 I4 SSR 5-GCCACACACA-3 S10 RAPD 5-AGATGCAGCC-3 表 C.5 猴头 菌 属核心 引物 对（一）编号 类 型 核 苷 酸 序列 编号 类 型 核 苷 酸 序列 I1 SSR 5-GCTGTGTGTG-3 S6 RAPD 5-CAGCACCCAC-3 I1 SSR 5-GCTGTGTGTG-3 S8 RAPD 5-GTCCACACGG-3 I2 SSR 5-GTTGTGTGTG-3 S6 RAPD 5-CAGCACCCAC-3 I3 SSR 5-GTCACACACA-3 S6 RAPD 5-CAGCACCCAC-3 I4 SSR 5-GCCACACACA-3 S8 RAPD 5-GTCCACACGG-3 表 C.6 猴头 菌 属核心 引物 对（二）编号 类 型 核 苷 酸 序列 编号 类 型 核 苷 酸 序列 I2 SSR 5-GTTGTGTGTG-3 S1 RAPD 5-GTGACATGCC-3 I2 SSR 5-GTTGTGTGTG-3 S2 RAPD 5-TTGGCACGGG-3 I2 SSR 5-GTTGTGTGTG-3 S3 RAPD 5-GGTGACGCAG-3 I2 SSR 5-GTTGTGTGTG-3 S5 RAPD 5-ACGCACAACC-3 I3 SSR 5-GTCACACACA-3 S4 RAPD 5-GTCGCCGTCA-3 DB22/T 2083 2014 10 表 C.7 分析用 SSR和 RAPD引物 编 号 类 型 核 苷 酸 序 列 I1 SSR 5-GCTGTGTGTG-3 I2 SSR 5-GTTGTGTGTG-3 I3 SSR 5-GTCACACACA-3 I4 SSR 5-GCCACACACA-3 S1 RAPD 5-GTGACATGCC-3 S2 RAPD 5-TTGGCACGGG-3 S3 RAPD 5-GGTGACGCAG-3 S4 RAPD 5-GTCGCCGTCA-3 S5 RAPD 5-ACGCACAACC-3 S6 RAPD 5-CAGCACCCAC-3 S7 RAPD 5-CCAGATGCAC-3 S8 RAPD 5-GTCCACACGG-3 S9 RAPD 5-CTGCTGGGAC-3 S10 RAPD 5-AGATGCAGCC-3 _