食用油中氧化甘油三酯（OX-TG）及其聚合物（TGP）的测定 高效空间排阻色谱法DB34／T 1997-2013.pdf

ICS 67.200.10 X 14 DB34 安 徽 省 地 方 标 准 DB 34/T 19972013 食用油中氧化甘油三酯（OX-TG）及其聚合物（TGP）的测定 高效空间排阻色谱法 Determination of oxidized triacylglycerol(OX-TG)and oxidized triacyldycerol polymer(TGP)in edible oils by a high-performance size-exclusion chromatography 2013-12-05 发布 2014-01-05 实施安徽省质量技术监督局 发 布 DB34/T 19972013 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。本标准由安徽省质量技术监督局、安徽省食品质量安全检验方法标准化技术委员会提出。本标准由安徽省食品质量安全检验方法标准化技术委员会归口。本标准起草单位：安徽国家农业标准化与监测中心、国家农副加工食品质量监督检验中心、上海市粮食科学研究所。本标准主要起草人：徐彦辉、何俊、房志杰、曹文明、顾亮、聂磊、薛斌、姚彦如。DB34/T 19972013 1 食用油中氧化甘油三酯（OX-TG）及其聚合物（TGP）的测定 高效空间排阻色谱法 1 范围 本标准规定了食用油中氧化甘油三酯（OX-TG）及其聚合物（TGP）的测定 高效空间排阻色谱法。本标准适用于食用油中氧化甘油三酯（OX-TG）及其聚合物（TGP）的测定。本标准的方法检出限为 0.2。本标准适用于风险监控及科学研究。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法（GB/T 6682-2008，neq ISO3696：1997）GB/T 6379.1 测量方法与结果的准确度(正确度与精密度)第1部分:总则与定义(GB/T 6379.1-2004，ISO5725-1：1994，IDT)GB/T 6379.2 测量方法与结果的准确度(正确度与精密度)第2部分:确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法(GB/T 6379.2-2004，ISO5725-2：1994，IDT)3 原理 通过自动制备型快速柱层析技术的分离，油脂试样被分为非极性组分和极性组分两部分，其中极性组分用高效空间排阻色谱进行分析，采用面积归一化法进行定量。4 试剂 4.1 除非另有说明，仅使用分析纯试剂，水为 GB/T 6682规定的一级水。4.2 乙醚，使用前使其回温至 1018之间。4.3 石油醚，3060沸程，使用前使其回温至 1018之间。4.4 三氯甲烷。4.5 冰醋酸。4.6 95乙醇。4.7 磷钼酸。4.8 无水硫酸钠。4.9 硅胶吸附剂：硅胶60，平均粒径为 0.063 mm0.200 mm（相当于 ASTM 规范的 70 目230目的粒径分布）的无定形硅胶，孔径 60，水分含量 70.5，孔体积 0.8 mL/g，表面积 500 m2/g，pH值 7.0,拆封后于玻璃干燥器（5.5）内保存。DB34/T 19972013 2 4.10 非极性洗脱剂：石油醚（3060沸程）+乙醚=87+13，870 mL 的石油醚（3060沸程）（4.2）中加入 130 mL的乙醚（4.1），充分混匀，现用现配。4.11 极性组分洗脱液：丙酮+乙醚=40+60，600 mL 的乙醚（4.1）中加入 400 mL 的丙酮（4.15），充分混匀，现用现配。4.12 薄层色谱展开剂：石油醚（3060沸程）+乙醚+冰醋酸=70+30+2，70 mL 的石油醚（3060沸程）（4.2）中加入 30 mL的乙醚（4.1）和 2 mL 的冰醋酸（4.4），充分混匀，现用现配。4.13 薄层色谱显色剂：100克的磷钼酸（4.6）固体先完全溶解于适量的 95乙醇（4.5）中，然后再用 95乙醇稀释至 1 L，最后分装入喷雾瓶中。4.14 薄层色谱层析板：长 200 mm、宽 100 mm 的玻璃板，上涂一层 0.25 mm 厚的硅胶 60（平均粒径为 1012 m，其它性质参数同“4.8”）或其它等效硅胶，且不含任何的荧光指示剂。4.15 薄层色谱点样毛细管：长 100 mm，内径 0.3 mm。4.16 丙酮,使用前使其回温度至 1018之间。4.17 食用油极性组分FLASH色谱柱（EOPC FLASH）：内填装 20 g 粒径为 40 m60 m的硅胶，柱外壳为聚丙烯制成，铝箔密封包装。4.18 10 mL一次性使用无菌注射器。5 仪器与设备 5.1 旋转蒸发仪。5.2 分析天平：感量为 0.1 mg。5.3 真空恒温干燥箱。5.4 恒温干燥箱。5.5 玻璃干燥器（内装有变色硅胶干燥剂）。5.6 薄层色谱玻璃层析缸，能与薄层色谱板（4.13）配套。5.7 食用油极性组分快速制备型柱层析系统（EOPC PFC SYSTEM）：配置二元泵、紫外检测器、自动收集系统、实时监测系统和溶剂温度控制系统。5.8 标准磨口 500 mL圆底烧瓶。5.9 10 mL玻璃烧杯。5.10 1000 mL小口玻璃收集瓶。6 分析步骤 6.1 试样的制备 6.1.1 除杂质 作为试样的样品应为液态、澄清、无沉淀并充分混匀。如果样品不澄清、有沉淀，则须将油脂置于50的水浴或恒温干燥箱（5.4）内，将油脂的温度加热至 50并充分振摇以熔化可能的油脂结晶。若此时油脂样品变为澄清、无沉淀，则可作为试样，否则应将油脂置于 50的恒温干燥箱（5.4）内，用滤纸过滤不溶性的杂质，取过滤后的澄清液体油脂作为试样，为防止油脂氧化，过滤过程应尽快完成。对于凝固点高于 50或含有凝固点高于 50油脂成分的样品，则须将油脂置于比其凝固点高 10左右的水浴或恒温干燥箱（5.4）内，将油脂加热并充分振摇以熔化可能的油脂结晶。若还需过滤，则将油脂置于比其凝固点高 10左右的恒温干燥箱（5.4）内，用滤纸过滤不溶性的杂质，取过滤后的澄清液体油脂作为试样，为防止油脂氧化，过滤过程应尽快完成。DB34/T 19972013 3 6.1.2 干燥脱水 若油脂中含有水分，则通过“5.1.1”的处理后仍旧无法达到澄清，须进行干燥脱水。对于室温下为液态、无明显结晶或凝固现象的油脂，以及经过“5.1.1”的处理并冷却至室温后为液态、无明显结晶或凝固现象的油脂，可按每 10 g 油脂加入 12 g 无水硫酸钠（4.7）的比例加入无水硫酸钠，并充分搅拌混合吸附脱水，然后用滤纸过滤，取过滤后的澄清液体油脂作为试样。对于室温下有结晶或凝固现象的油脂，以及经过“5.1.1”的处理并冷却至室温后有明显结晶或凝固现象的油脂，可将油脂样品用适量的石油醚（4.2）完全溶解后再用无水硫酸钠吸附脱水，然后滤纸过滤收集滤液，将滤液置于水浴温度为 45的旋转蒸发仪（5.1）内，负压条件下，将其中的溶剂旋转蒸干，取残留的澄清液体油脂作为试样。6.2 FLASH色谱柱的活化 以非极性组分洗脱液（4.9）为流动相对 EOPC PFC SYSTEM 层析系统（5.7）的流动相管路进行润洗，排尽流动相管路内的气体。取 1 支 EOPC FLASH 色谱柱（4.16），连接入 EOPC 快速制备型柱层析系统的流动相管路，以非极性组分洗脱液（4.9）为流动相，25 mL/min 的流速冲洗 FLASH 色谱柱 10 min，使 FLASH 色谱柱完全被溶剂所浸润。6.3 非极性组分的分离 取 1 只干净的 10 mL 玻璃烧杯（5.9），准确称取 1 g（精确到 0.001 g）的油脂样品（m），然后用 5 mL 的石油醚（3060沸程）（4.2）将油脂样品充分溶解，成为上样液。将 FLASH 色谱柱的上端与流动相管路断开，用 1 支干净的 10 mL 一次性塑料注射器（4.17）吸取全部的上样液后，快速注射入 FLASH 色谱柱的上端入口处，再用 3 mL 的石油醚（3060沸程）洗涤 10 mL 玻璃烧杯内残留的上样液，洗涤液也用同一支 10 mL一次性塑料注射器全部吸取后，注射入 FLASH 色谱柱的上端入口处，再将 FLASH 色谱柱的上端与流动相管路连接，按以下参数进行非极性组分的分离：a)流动相：非极性组分洗脱液（4.9）；b)流动相流速：25 mL/min；c)部分收集器：以 1000 mL 小口玻璃收集瓶（5.10）为收集容器，从洗脱开始以全收集模式进行收集；d)紫外检测器监测波长：200 nm；e)启用实时监测系统，获得洗脱色谱图；f)溶剂温度控制系统温度：10；g)洗脱时间：11 min。注：进行分离操作时，实验的环境温度应控制在 1025间。6.4 极性组分的洗脱 取 1 个干净的 500 mL 圆底烧瓶（5.8）放入（1032）的恒温干燥箱（5.4）内，烘 1 h 左右，然后取出立即放入玻璃干燥器（5.5）内冷却至室温，然后称重（M1）。在完成“6.3”的操作后，立即对吸附有极性组分的 FLASH 色谱柱进行进一步的洗脱处理，具体参数如下：a)流动相：极性组分洗脱液（4.10）；b)流动相流速：25mL/min；c)部分收集器：以另一个干净的 1000 mL 小口玻璃收集瓶（5.10）为收集容器，从洗脱开始以全收集模式进行收集；d)紫外检测器监测波长：200 nm；DB34/T 19972013 4 e)启用实时监测系统，获得洗脱色谱图；f)溶剂温度控制系统温度：10；g)洗脱时间：20 min。将 1000 mL 小口玻璃收集瓶内所有收集的洗脱液倒入 500 mL 圆底烧瓶中，然后将此装有收集洗脱液的 500 mL 圆底烧瓶置于水浴温度为 60的旋转蒸发仪（5.1）内，先在非真空条件下，将其中的溶剂旋转蒸发至一半，再在负压条件下，将其中的溶剂旋转蒸发至近干。然后将此 500 mL 圆底烧瓶放入 40的真空恒温干燥箱（5.3），在 0.1 MPa 的负压条件下，烘 20 min30 min 后放入玻璃干燥器（5.5）内冷却至室温，其中的残留物即为极性组分。然后称重（M2）,（M2-M1）即为极性组分的质量。用 100 mL 的四氢呋喃溶解极性组分，待上机分离检测。获得的非极性组分和极性组分的分离效果须按照附录C进行验证。注1：若洗脱液的量太大，可分多次收集并浓缩，即先收集部分洗脱液于 500 mL 的圆底烧瓶中，旋转蒸干这部分溶剂后，再用同一个 500 mL 的圆底烧瓶继续收集剩余的洗脱液，并旋转蒸干。注2：一般情况下，油脂的极性组分中含有甘油三酯氧化裂解产生的小分子挥发性物质，很难避免这类物质在真空干燥过程中的损失，致使本标准测得的极性组分含量会比真实的极性组分含量略低。6.5 平行试验 按试样处理步骤，对同一样品进行平行试验测定。6.6 测定 6.6.1 空间排阻色谱分析条件 a)色谱柱：Styragel 凝胶色谱保护柱+Styragel HR 1 TH(7.8mm300mm)+Styragel HR 0.5 TH(7.8 mm300 mm)或柱效相当的串联空间排阻色谱柱；b)柱温：35；c)进样量：10 L；d)流速：0.7 mL/min；e)流动相：四氢呋喃；f)检测器：示差折光检测器（检测池温度35）。6.6.2 定性测定 依据聚苯乙烯标准相对分子质量进行定性，油样极性组分典型的色谱分离图见附录B。各组分依分子量大小顺序出峰，对应的色谱峰依次为氧化甘油三酯寡聚物(TGO)、氧化甘油三酯二聚物(TGD)、氧化甘油三酯单体(OX-TG)、甘油二酯(DG)、游离脂肪酸(FFA)等。6.6.3 定量测定 假设所有洗脱出的样品组分具有相同的响应系数，采用峰面积归一化法进行定量测定。6.7 结果计算 氧化甘油三酯按式（1）计算：%100)(1 MMS S S S SSXpOTH DG TG OX TGD TGOTG OX.(1)DB34/T 19972013 5 氧化甘油三酯聚合物含量按式（2）计算：%100)()(2 MMS S S S SS SXpOTH DG TG OX TGD TGOTGD TGO.(2)式中：X1 油样中氧化甘油三酯的含量，；X2 油样中氧化甘油三酯聚合物的含量，；STGO 氧化甘油三酯寡聚物(TGO)的峰面积；STGD 氧化甘油三酯二聚物(TGD)的峰面积；SOX-TG氧化甘油三酯单体(OX-TG)的峰面积；SDG 甘油二酯单体(DG)的峰面积；SOTH 其它洗脱组分的峰面积（包括游离脂肪酸和甾醇等）；MP 油样中极性物质量,g；M 油样质量,g。注：结果保留至小数点后两位。7 检测方法灵敏度和精密度 7.1 灵敏度 氧化甘油三酯及其聚合物含量在油脂中的检测限为 0.2。7.2 精密度 在重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值应不超过算术平均值的 15。DB34/T 19972013 6 A A 附 录 A（资料性附录）极性组分和非极性组分自动快速制备型柱层析分离的典型色谱图 图A.1 非极性组分和极性组分自动快速制备型柱层析分离的典型色谱图 DB34/T 19972013 7 B B 附 录 B（资料性附录）极性物在空间排阻色谱上的典型空间排阻分离色谱图 图B.1 极性物含量较高的典型空间排阻色谱图 图B.2 极性物含量较低的典型色谱图 DB34/T 19972013 8 C C 附 录 C（资料性附录）非极性组分和极性组分洗脱分离效果的薄层色谱验证 用三氯甲烷（4.3）分别将分离制备的极性组分和非极性组分配制成质量体积浓度为 10左右的溶液。用 2 根点样毛细管（4.14）分别吸取各 2 L 左右的极性组分溶液和非极性组溶液，在距离薄层色谱层析板（4.13）下沿 3 cm 左右处，分别点样并挥干溶剂。薄层色谱玻璃层析缸（5.6）内加入适量的薄层色谱展开剂（4.11），放入点有样的薄层色谱层析板（注：展开剂的液面不得高于点样点的高度）进行展开。约 35 min 后，当展开剂的液面展开至薄层色谱层析板上端 17 cm 左右的距离时，取出薄层色谱层析板，并在室温下挥干溶剂。以喷雾的方式，将薄层色谱显色剂（4.12）均匀地喷涂在薄层色谱层析板的硅胶涂层的表面，并在室温下挥干溶剂。然后将此薄层色谱层析板放入 120130 的恒温干燥箱（5.4）内加热至斑点显色。根据薄层色谱层析板上极性组分与非极性组分的分离程度来验证分离效果，如图C.1。图中：1非极性组分 2极性组分 图C.1 极性组分和非极性组分的薄层色谱图 _