水产养殖环境中杆菌肽、粘菌素及维吉尼霉素残留量的测定DB35／T 1499-2015.pdf

ICS 13.060.50 Z 16 DB35 福建省地方标准 DB35/T 14992015 水产养殖环境中杆菌肽、粘菌素及 维吉尼霉素残留量的测定 Determination of Bacitracin,Colistin and Virginiamycin residues in aquaculture environment 2015-02-28发布 2015-06-01实施福建省质量技术监督局 发布 DB35/T 14992015 I 前 言 本标准按照GB/T 1.12009标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写给出的规则编写。本标准由福建省海洋与渔业厅提出并归口。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准起草单位：福建省水产研究所、福建省渔业环境监测站、农业部渔业产品质量监督检验测试中心（厦门）。本标准主要起草人：罗冬莲、罗方方、钱卓真、汤水粉、叶玫、吴成业。DB35/T 14992015 1 水产养殖环境中杆菌肽、粘菌素及维吉尼霉素残留量的测定 警告：使用本标准的人员应有正规实验室工作的实验经验，应熟知下述化学处理操作和仪器操作安全。本标准并未指出所有可能的安全问题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。1 范围 本标准规定了水产养殖环境（水体和沉积物）中杆菌肽、粘菌素及维吉尼霉素M1残留量测定的高效液相色谱-串联质谱法。本标准适用于水产养殖环境（水体和沉积物）中杆菌肽、粘菌素及维吉尼霉素M1残留量的检测。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法 GB 17378.3-2007 海洋监测规范 第3部分：样品采集、贮存与运输 3 原理 水样经过滤、酸化后，采用固相萃取方法富集和净化；沉积物经甲醇-柠檬酸-磷酸氢二钠溶液超声提取，乙二胺四乙酸二钠络合除杂，甲基异丁基甲酮萃取，固相萃取柱富集净化；高效液相色谱-串联质谱法测定，基质匹配标准曲线法定量。4 试剂和材料1)本标准所用试剂除非另有规定，使用的试剂为分析纯，水为GB/T 6682-2008规定的一级水。4.1 硫酸粘菌素标准品：纯度78.3%。4.2 杆菌肽标准品：纯度77.0%。4.3 维吉尼霉素 M1标准品：纯度95.0%。4.4 甲醇：色谱纯。4.5 甲酸：优级纯。4.6 正己烷：色谱纯。4.7 乙腈：色谱纯。4.8 一水柠檬酸。4.9 十二水磷酸氢二钠。4.10 甲基异丁基甲酮：色谱纯。1)称取标准品的质量是按纯度修正过的质量。DB35/T 14992015 2 4.11 乙二胺四乙酸二钠。4.12 0.1 mol/L的柠檬酸溶液：取一水柠檬酸（4.8）21.01 g，用水溶解并稀释至 1000 mL。4.13 0.2 mol/L的磷酸氢二钠溶液：取十二水磷酸氢二钠（4.9）71.63 g，用水溶解并稀释至 1000 mL。4.14 柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液：取 0.1 mol/L的柠檬酸溶液（4.12）1000 mL和 0.2 mol/L的磷酸氢二钠溶液（4.13）625 mL，混合均匀。4.15 甲醇-柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液：取甲醇（4.4）300 mL和柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液（4.14）400 mL，混合均匀。4.16 0.1%的甲酸甲醇溶液：取甲酸（4.5）1 mL，用甲醇（4.4）稀释至 1000 mL。4.17 0.1%的甲酸水溶液：取甲酸（4.5）1 mL，用水稀释至 1000 mL。4.18 定容液：取 0.1%甲酸水溶液（4.17）80 mL 和乙腈（4.7）20 mL，混合均匀。4.19 0.1%甲酸乙腈溶液：取甲酸（4.5）1 mL，用乙腈（4.7）稀释至 1000 mL。4.20 Oasis HLB 固相萃取柱：500 mg/6 mL；或相当者。4.21 Oasis HLB 固相萃取柱：200 mg/6 mL；或相当者。4.22 标准储备液：准确称取硫酸粘菌素（4.1）、杆菌肽（4.2）各 20 mg（精确至 0.1 mg）于 100 mL棕色容量瓶中，用 0.1%的甲酸水溶液（4.17）溶解并稀释至刻度，配制成 200 mg/L的混合标准储备液，4 下避光保存，有效期 1 个月；准确称取维吉尼霉素 M1（4.3）10 mg（精确至 0.1 mg）于 100 mL 棕色容量瓶中，用甲醇（4.4）溶解并稀释至刻度，配制成 100 mg/L的标准储备液，-18 下避光保存，有效期 6 个月。4.23 混合标准中间液：准确移取 200 mg/L粘菌素和杆菌肽混合标准储备液（4.22）1 mL 于 10 mL 棕色容量瓶中，用 0.1%的甲酸水溶液（4.17）稀释至刻度，配制成 20 mg/L的混合标准中间液，4 下避光保存，有效期 10 天；准确移取 100 mg/L 维吉尼霉素 M1标准储备液（4.22）1 mL于 10 mL棕色容量瓶中，用甲醇（4.4）稀释至刻度，配制成 10 mg/L的标准中间液，4 下避光保存，有效期 2 个月。5 仪器与设备 5.1 高效液相色谱-串联质谱仪：配电喷雾离子源。5.2 分析天平：感量 0.1 mg。5.3 天平：感量 0.01 g。5.4 离心机：4000 r/min。5.5 涡漩混合器：3000 r/min。5.6 离心管：50 mL。5.7 水浴氮吹仪。5.8 水相滤膜：0.45 m。5.9 有机相针式过滤器：0.22 m。5.10 超声波清洗器。5.11 真空泵。5.12 固相萃取装置。6 样品的采集、制备与保存 6.1 水样采集与保存 DB35/T 14992015 3 按GB 17378.3-2007的规定，将现场采集的1 L水样装入小口棕色玻璃瓶中，盖紧，避光运回实验室，2 8 保存。6.2 沉积物采集、制备与保存 按GB 17378.3-2007的规定，将现场采集的500 g沉积物样品装入棕色广口玻璃瓶中，盖紧，避光运回实验室。剔除沉积物中砾石和杂物，置阴凉通风处风干后，经研磨，过80目筛后，储于小口玻璃瓶中，于阴凉处保存。7 试样的前处理 7.1 水样前处理 水样抽滤过膜（5.8）。移取100 mL过滤的水样于三角瓶中，加入甲酸（4.5）调节pH至2.53.0。Oasis HLB固相萃取柱（4.20）依次用甲醇（4.4）5 mL、水5 mL预活化，上样，水15 mL淋洗，控制流速为每秒一滴，甲醇（4.4）3 mL洗脱，收集全部洗脱液于玻璃试管中，40 氮吹至干。用定容液（4.18）1 mL复溶，混匀，过0.22 m有机相针式过滤器，供高效液相色谱-串联质谱仪测定。7.2 沉积物前处理 7.2.1 提取 称取5 g0.05 g过筛后的沉积物样品于50 mL离心管内，依次加入乙二胺四乙酸二钠（4.11）0.5 g、甲醇-柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液（4.15）10 mL、2000 r/min涡旋混合1 min，超声提取10 min、3500 r/min离心5 min，取上清液，残渣再加入甲醇-柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液（4.15）10 mL重复提取1次，合并上清液至另一50 mL离心管。7.2.2 液-液萃取净化 上述清液（7.2.1）中加入甲基异丁基甲酮（4.10）5 mL，2000 r/min涡旋混合1 min，3500 r/min离心5 min，将上层液转移至15 mL玻璃试管中，重复上述操作一次。合并两次甲基异丁基甲酮提取液于40 氮吹至干，甲醇（4.4）1 mL复溶后与下层液合并，待固相萃取柱净化。7.2.3 固相萃取净化 Oasis HLB固相萃取柱（4.21）依次用甲醇（4.4）5 mL、水5 mL预活化，上样，水10 mL淋洗，控制流速为每秒一滴，甲醇（4.4）3 mL、0.1%甲酸甲醇溶液（4.16）3 mL依次洗脱，收集全部洗脱液于玻璃试管中，40 氮吹至干。用定容液（4.18）1 mL复溶，混匀，过0.22 m有机相针式过滤器，供高效液相色谱-串联质谱仪测定。8 测定 8.1 液相色谱条件 8.1.1 色谱柱：CAPCELL PAK MGII C18 柱（2.0 mm150 mm,5 m）或性能相当者。8.1.2 流动相 A：0.1%甲酸水溶液。8.1.3 流动相 B：0.1%甲酸乙腈溶液。8.1.4 梯度洗脱程序见表 1。DB35/T 14992015 4 表1 流动相梯度洗脱程序 时间 min A%B%0 90 10 2 90 10 4 25 75 9 25 75 10 90 10 12 90 10 8.1.5 流速：0.2 mL/min。8.1.6 柱温：25。8.1.7 进样量：10 L。8.2 质谱条件 8.2.1 离子源：电喷雾（ESI）离子源。8.2.2 扫描方式：正离子扫描。8.2.3 检测方式：多反应监测（MRM）。8.2.4 电喷雾电压：4500 V。8.2.5 毛细管温度：300。8.2.6 雾化气压力：241.3 KPa。8.2.7 辅助气压力：13.8 KPa。8.2.8 定性离子对、定量离子对和碰撞能量见表 2。表2 杆菌肽、粘菌素及维吉尼霉素 M1的定性离子对、定量离子对和碰撞能量 化合物 定性离子对 m/z 定量离子对 m/z 碰撞能量 ev 712.0/198.8 39 杆菌肽 A（BTCA）712.0/226.7 712.0/198.8 30 705.0/198.8 39 杆菌肽 B（BTCB）705.0/252.8 705.0/198.8 48 391.0/384.8 11 粘菌素 A（CSA）391.0/378.8 391.0/384.8 14 386.0/379.9 10 粘菌素 B（CSB）386.0/374.1 386.0/379.9 14 525.3/337.0 20 维吉尼霉素 M1（VGM M1）525.3/355.0 525.3/337.0 15 8.3 基质匹配标准曲线的制备 准确移取适量混合标准中间液（4.23）和标准储备液（4.22），用空白阴性样品提取液分别配成粘菌素和杆菌肽浓度为 10 g/L、50 g/L、500 g/L、1000 g/L、2500 g/L、5000 g/L、10000 g/L，维吉尼霉素 M1浓度为 4 g/L、20 g/L、200 g/L、400 g/L、1000 g/L、2000 g/L、4000 g/L的系列DB35/T 14992015 5 基质标准工作液；使用时现配现用。以特征离子质量色谱峰面积为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。求回归方程和相关系数。8.4 样品测定 8.4.1 定性测定 在相同测试条件下，试样液中与基质标准工作液中目标物质的保留时间相比较，偏差在5%以内，且在目标物中检测到的定性离子对的相对丰度，与浓度相当的基质标准工作液中定性离子对相对丰度进行比较，若偏差不超过表3规定的范围，则可认为试样中存在对应的待测物。表3 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度（K）%允许偏差%K50 20 20K50 25 10K20 30 K10 50 8.4.2 定量测定 按8.1和8.2设定仪器条件，取试样液和相应的基质标准工作液，按外标法，以峰面积定量。基质标准工作液及试样液中的杆菌肽、粘菌素及维吉尼霉素M1响应值均应在仪器检测的线性范围内，定量离子采用丰度最大的二级特征离子碎片。标准物质多反应监测离子流色谱图参见附录A。8.5 空白实验 除不加试样外，均按上述测定步骤进行。8.6 平行实验 按照上述步骤，对同一试样进行平行实验测定。9 结果计算 按公式（1）计算水体中目标物质的残留量，按公式（2）计算沉积物中目标物质的残留量，计算结果均需扣除空白值：10001000 vV CXi.(1)式中：X 试样中目标物质的残留量，单位为微克每升（g/L）；Ci 试样提取液中目标物的残留量，单位为微克每升（g/L）；V 试样最终定容体积，单位为毫升（mL）；试样体积，单位为毫升（mL）。DB35/T 14992015 6 1000 110002）（O HimV CX.(2)式中：X 试样中目标物的残留量，单位为微克每千克（g/kg）；Ci 试样提取液中目标物的残留量，单位为微克每升（g/L）；V 试样最终定容体积，单位为毫升（mL）；m 试样质量，单位为克（g）。O H2 风干样的含水率（质量分数，%）。注：杆菌肽含量为杆菌肽A和杆菌肽B含量之和，粘菌素含量为粘菌素A和粘菌素B含量之和。10 方法灵敏度、准确度和精密度 10.1 灵敏度 水体样品：杆菌肽、粘菌素的检出限为0.25 g/L，维吉尼霉素M1的检出限为0.1 g/L；杆菌肽、粘菌素的定量限为0.5 g/L，维吉尼霉素M1的定量限为0.2 g/L。沉积物样品：杆菌肽、粘菌素的检出限为5 g/kg，维吉尼霉素M1的检出限为2 g/kg；杆菌肽、粘菌素的定量限为10 g/kg，维吉尼霉素M1的定量限为4 g/kg。10.2 准确度 水体样品：杆菌肽、粘菌素添加浓度0.5 g/L50 g/L，维吉尼霉素M1添加浓度0.2 g/L20 g/L时，回收率为70%120%。沉积物样品：杆菌肽、粘菌素添加浓度10 g/kg1000 g/kg，维吉尼霉素M1添加浓度4 g/kg 400 g/kg时，回收率为70%120%。10.3 精密度 本方法的相对标准偏差小于等于15%。A DB35/T 14992015 7 A B 附 录 A（资料性附录）多反应监测离子流色谱图 标准品多反应监测离子流色谱图见图A.1，加标水样多反应监测离子流色谱图见图A.2，加标沉积物多反应监测离子流色谱图见图A.3。注：粘菌素20 g/L；杆菌肽20 g/L；维吉尼霉素M1 8 g/L。图A.1 标准品多反应监测离子流色谱图 RT:0.00-12.000 2 4 6 8 10Time(min)050100050100050100050100Relative Abundance050100050100RT:5.71RT:6.92RT:5.45RT:5.50RT:6.75RT:5.69RT:5.71粘菌素 B 粘菌素 A维吉尼霉素 M1杆菌肽 B 杆菌肽 ANL:2.47E3 DB35/T 14992015 8 注：粘菌素5 g/L；杆菌肽5 g/L；维吉尼霉素M1 2 g/L。图A.2 加标水样多反应监测离子流色谱图 NL:4.68E4 RT:0.00-12.010 2 4 6 8 10Time(min)050100050100050100050100Relative Abundance050100050100RT:6.68RT:5.49RT:5.42RT:5.49RT:6.69RT:5.67RT:5.73杆菌肽 A杆菌肽 B维吉尼霉素 M1粘菌素 A粘菌素 BDB35/T 14992015 9 注：粘菌素100 g/kg；杆菌肽100 g/kg；维吉尼霉素M1 40 g/kg。图A.3 加标沉积物多反应监测离子流色谱图 _ RT:0.00-12.000 2 4 6 8 10Time(min)050100050100050100050100Relative Abundance050100050100RT:5.50RT:5.51RT:7.76RT:5.43RT:5.49RT:6.69RT:5.67RT:5.68粘菌素 B粘菌素 A维吉尼霉素 M1杆菌肽 B杆菌肽 ANL:5.21E4 DB35/T 14992015 福建省地方标准 水产养殖环境中杆菌肽、粘菌素及 维吉尼霉素残留量的测定 DB35/T 14992015*2015年 5月第一版 2015年 5月第一次印刷