鼠疫耶尔森菌核酸的测定 荧光PCR方法DB22／T 2081-2014.pdf

ICS 11.020 B 41 DB22 吉林省 地方标准 DB 22/T 2081 2014 鼠疫耶尔森菌核酸的测定 荧光 PCR方法 Method of fluorescence PCR for the detection of Yersinia pestis 2014-05-04发布 2014-06-01实施 吉林省质量技术监督局 发布 DB22/T 2081 2014 I 前 言 本标准依据 GB/T 1.1-2009、GB/T 20001.4-2001给出的规则起草。本标准由吉林出入境检验检疫局提出并归口。本标准起草单位：吉林出入境检验检疫局检验检疫技术中心。本标准主要起草人：王玮琳、刘阳、孙舒、聂丹丹、陈光宇、刘韬、刘金华、罗雁非、郑旭 DB22/T 2081 2014 1 鼠疫耶尔森菌核酸的测定 荧光 PCR法 1 范围 本标准规定了鼠疫耶尔森菌核酸的测定 荧光 PCR法。本标准适用于鼠疫耶尔森菌的实验室检测。2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的 版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新 版本（包括 所 有 的 修改 单）适用于本文件。GB 19489 实验室 生物安全 通用要 求 GB/T 6682 分析 实验室用 水 规 格和 实验 方 法 3 警告 为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员进行检测。培养物和废物应小心处置，并按 GB 19489中的有关规定执行。试样制备及核酸提取过程需在生物安全二级及以 上 实验室 内 进行。4 缩略语 下列 缩略语 适用于本文件。PCR:聚合酶链反应（Polymerase chain reaction）。DNA:脱氧 核 糖 核酸（Deoxyribonucleic acid）。Taq酶:DNA聚合酶。FAM:6-羧基-荧光 素（一种 荧光 报告基团）（6-Carboxy-fluorescein）。TTAMRA（Carboxytetramethylrhodamine）。TE:缓冲液(Tris-Cl EDTA)。Tm值:核酸 融解温度（Melting tempreture）。Ct值:每个反应管内 的荧光 信号量达到设 定的 阈值时 所 经历 的 循环数(Cycle threshold)。5 原理 实 时 荧光 PCR方 法，是 在 PCR反应体系 中 加 入荧光 基团，利 用荧光 信号积累，实 时监 测 整个 PCR进程，最后 通过荧光 信号 的 增幅情况来判 定 反应结果。PCR反应体系 中 加 入 一对 引 物 的 同时加 入 一 条 特异性 荧 光 探针，探针两端分别 标 记 荧光 报告基团和 荧光 淬灭 基团，PCR扩 增时，利 用 Taq酶 的 水解 作 用，使 探针上 的荧光 报告基团 远离淬灭 基团 而 发 出荧光 信号，荧光检测 系 统可接收 到 荧光 信号，此 方 法检测的是 积 累 荧光。TAMRA探针（Carboxytetramethylrhodamine，羧基 四甲 基 罗丹 明），是罗丹 明类 荧光 素 衍 生物，TAMRA易 于 被 mercury arc lamps 的 546nm光 谱线 所 激发，且比 荧光 素 具 有 更好 的光 稳 定 性和 敏感 性。6 试 剂与材料 DB22/T 2081 2014 2 6.1 所 用 水 应 符合 GB/T 6682 中的规定。6.2 除特别说明 以 外，所 用试 剂均 为 分析纯或 生 化 试 剂。6.3 引物及 探针 上游 引 物 5-GTTAATACCAAATATATCCCTGA-3，下 游 引 物 5-TCTGCGTCATAAAGCATTC-3，探 针 FAM TGCAGCCTCCACCGGGATGC-TAMRA 6.4 10%SDS 在 900ml水 中 溶 解 100g电泳级 SDS，加 热至 68助溶，加 入 几滴浓盐 酸 调节溶 液 的 pH值 至 7.2，加水 定 容至 1L，分 装备 用。6.5 20mg/ml蛋白酶 K 将 200mg的 蛋白 酶 K加 入 到 9.5ml水 中，轻轻摇动，直至蛋白 酶 K完 全 溶 解。不要 涡旋混 合。加水 定 容 到 10ml，然 后分 装 成 小份贮存 于-20。6.6 CTAB/NaCl溶液 在 80mL水 中 溶 解 4.1gNaCl，缓 慢 加 入 10g CTAB，同时加 热 并 搅拌，如 果 需 要，可 加 热至 65使 其 溶 解，定 容终 体积 至 100mL。6.7 10 TE缓冲液(pH 8.0)量 取 1mol/L Tris-HCl(pH 8.0)25mL,0.5mol/L EDTA(pH 8.0)1mL,置 于 100mL烧杯 中。向烧杯 中加 入 约 40mL的 去离子 水，混 合 均匀，定 容至 50 mL后，高压灭 菌 备 用。6.8 0.5mol/L EDTA 在 800mL水 中 加 入 186.1g二 水 乙二胺四乙 酸 二钠（EDTA-Na2 2H2O），在 磁力搅拌器上剧烈搅拌，用 NaOH调节溶 液 的 pH值 至 8.0（约需 20g NaOH颗 粒）然 后 定 容至 1 L，分 装 后 高压灭 菌 备 用。7 仪器设 备 7.1 荧光定量 PCR系统。7.2 生物安全 柜。7.3 高压灭 菌 锅。7.4 高速台式冷冻离 心 机（10000r/m、生物安全 型）。7.5 组织匀浆仪（生物安全 型）。7.6 涡旋混合器。7.7 低温冰箱（-80）、冷藏冷冻冰箱（2 8 和-20）。7.8 微 量 移液器。DB22/T 2081 2014 3 7.9 恒温水浴箱。7.10 微 量 离 心 管：1.5mL。8 试样制备 8.1 取 25mg 30mg动 物 组织，放 入 1.5mL离 心 管 中,加 入 500 L TE缓冲液,用 匀 浆仪研碎。匀 浆 液10000r/min,离 心 2min，弃 上 清，沉淀 备 用。8.2 将 菌 液 制 备 成 悬浊 液，10000r/min,离 心 2min，弃 上 清，沉淀 备 用。9 检测 步骤 9.1 DNA提取 在 上 述样品沉淀 中 加 入 560 L TE缓冲液，反 复吹打 使 之重悬，加 入 30 L的 10%SDS和 3 L蛋白 酶 K（20mg/mL），混匀，37 孵育 1h；加 入 100 L 5mol/L NaCl,充 分 混匀，再 加 入 80 L CTAB/NaCl溶 液，混匀，65 温 育 10 min；加 入 等 体积 的 氯仿/异 戊醇，混匀，12000 r/min 离 心 5 min，将上 清转 入 一新 离 心 管 中；加 入 0.6倍 体积异 丙醇，轻轻混 合 直 到 DNA沉淀 下 来，10000 r/min 离 心 15min,去上 清；75%乙 醇洗 一 次，去上 清，干燥，加 入 50 L的 TE缓冲液 溶 解 DNA备 用。也 可使 用 商业化 的 DNA提 取 试剂盒 提 取。9.2 实 时 荧光 PCR检测 反应体系 总 体积 为 25 L，其 中 含：TaqMan Mix缓冲液 12.5 L、上 下引 物（10 mol/L）各 1 L、探针（5 mol/L）1 L、模板 DNA 5 L、水 4.5 L。第 一 阶段，95 15min，1个循环；第 二 阶段，94 10s，62 45s，40个循环；荧光 收 集 设 置 在62 45s时进 行。不 同 仪 器、不 同 Taq DNA聚合酶 可 根 据要 求 将 反应 条件 做 适 当 调 整。9.3 对照 标准 空 白 对 照：以 水 代替 DNA模板。阴 性对 照：非 目 标菌的 DNA作 为荧光 PCR反应 的 模板。阳 性对 照：鼠疫耶尔森菌核酸 作 为荧光 PCR反应 的 模板。10 结果判 定及 报 告 10.1 PCR有 效 性 判断 空 白 对 照：无 TAMRA荧光 信号，相 应 Ct值 40。阴 性对 照：无 TAMRA荧光 信号，相 应 Ct值 40。阳 性对 照：有 TAMRA荧光 信号，且 TAMRA通 道 出 现 明 显 的 扩 增 曲 线，相 应 Ct值 36。否 则 判 断 为 PCR无效。10.2 结果分析条 件 设 定 待 测 样品 Ct值 大 于 或等 于 40，内 参照 基 因 检测 Ct值在 20 35之间者，阴 性对 照、阳 性对 照 和 空 白 对照 结果 正常者，则 可 判 定 该样品阴 性。DB22/T 2081 2014 4 待 测 样品 Ct值 小 于 40，内 参照 基 因 检测 Ct值在 20 35之间者，阴 性对 照、阳 性对 照 和 空 白 对 照 结果 正常者，则 可 判 定 该样品 阳 性。待 测 样品 Ct值在 36 40之间，应 重做 实 时 荧光 PCR扩 增。再次 扩 增后 的 结果 Ct值 仍 小 于 40者，且 阴性对 照、阳 性对 照 和 空 白 对 照 结果 正常，则 可 判 定 该样品 阳 性；再次 扩 增后结果 Ct值 大 于 40，且 阴 性对照、阳 性对 照 和 空 白 对 照 结果 正常，可 判 定 该样品阴 性。11 废 弃 物处 理 检验过 程 中的 废弃 物 按照 有 关 规定 进 行无害化处理。