水禽禽1 型副黏病毒病诊断技术DB35／T 1500-2015.pdf

ICS 11.220 B 41 DB35 福建省地方标准 DB35/T 15002015 水禽禽1型副黏病毒病诊断技术 Diagnostic protocol of disease caused by avian paramyxovirus type 1 in waterfowl 2015-02-28 发布 2015-06-01 实施福建省质量技术监督局 发布 DB35/T 15002015 I 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写给出的规则编写。本标准由福建省农业科学院提出。本标准由福建省农业厅归口。本标准起草单位：福建省农业科学院畜牧兽医研究所、福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心。本标准主要起草人：傅光华、黄瑜、白泉阳、施少华、程龙飞、傅秋玲、万春和、陈红梅、彭春香、吴波平、陈珍。DB35/T 15002015 1 水禽禽1型副黏病毒病诊断技术 1 范围 本标准规定了鸭（鹅）禽1型副黏病毒病的临床诊断要点及强毒株与低毒力株鉴别诊断的反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）的操作技术规程。本标准适用于不同品种鸭（鹅）的禽1型副黏病毒病的诊断。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 16550 新城疫诊断技术 3 疫病概述 禽1型副黏病毒，又称为新城疫病毒，该病毒仅有一个血清型，可感染大多数的禽类，包括鸡、鸭、鹅和鸽等，引起禽类发病率和死亡率的高低与毒株的致病力和感染宿主的种类、日龄及其机体免疫抵抗力等因素有关，且家养水禽（鸭、鹅）发生禽1型副黏病毒病时，其临床剖检病变有别于鸡新城疫。4 临床诊断 4.1 临床症状 当鸭、鹅出现以下部分或全部症状时，可作为初步诊断的依据之一：a)出现扭颈、侧翻、角弓反张、腿麻痹/瘫痪或共济失调等神经症状；b)产蛋母鸭（鹅）出现产蛋异常；c)腹泻或呼吸道症状。4.2 剖检病变 当鸭、鹅出现以下肉眼可见的剖检病变时，可作为初步诊断的依据之一：a)胰腺散布针尖状白色坏死点或（和）出血点；b)脾脏肿大，表面有白色坏死点（灶）（适用于鹅）；c)消化道粘膜有局灶性出血或坏死、溃疡、结痂；d)脑组织出血或充血。4.3 实验室确切诊断 当鸭、鹅出现4.1的临床症状之一或4.2的剖检病变之一时，应进行实验室确切诊断。5 样品采集与处理 DB35/T 15002015 2 5.1 样品采集 对于发病鸭（鹅）群，采集的样品为发病鸭（鹅）咽喉棉拭子和泄殖腔棉拭子，泄殖腔棉拭子需带有粪便；采集雏鸭（鹅）泄殖腔棉拭子较为困难时，可收集其新鲜粪便代替。对于病死鸭，则采集胰腺、脾脏及脑组织。5.2 样品处理 采集的样品置于样品保存液中，其中组织和咽喉棉拭子的样品保存液配制方法见附录A.1.2；泄殖腔棉拭子（或粪便）样品保存液的配制方法见附录A.1.3。磨碎的组织或粪便与含抗生素的PBS按1:4的比例制成悬浮液，棉拭子则置于2 mL含抗生素的PBS中充分振荡。上述样品在37 作用60 min或4 作用12 h，棉拭子在反复挤压后弃去。6 反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）诊断以及强毒株与低毒力株的鉴别 6.1 主要仪器设备 6.1.1 PCR 仪。6.1.2 高速台式冷冻离心机。6.1.3 生物安全柜。6.1.4 微量移液器。6.1.5 组织匀浆器。6.1.6 电泳仪。6.1.7 电泳槽。6.1.8 紫外凝胶成像系统。6.2 试剂 6.2.1 RNA 提取试剂Trizol。6.2.2 三氯甲烷。6.2.3 异丙醇。6.2.4 焦碳酸二乙酯（DEPC）处理水：配制方法见附录 A.3。6.2.5 75乙醇：用新开启的无水乙醇和 DEPC 水配制，-20 预冷。6.2.6 商品化的、经过操作者检验合格的一步法 RT-PCR 试剂盒。6.2.7 溴化乙锭：见附录 A.4。6.2.8 1TAE 缓冲液：见附录 A.5。6.2.9 1琼脂糖凝胶：见附录 A.6。6.2.10 DNA 相对分子质量标准物 Marker：DL2000。6.2.11 10加样缓冲液：见附录 A.7。6.3 引物 参见附录B。6.4 试验步骤 6.4.1 样品核酸的提取 DB35/T 15002015 3 6.4.1.1 对于样品核酸的提取按 6.4.1.26.4.1.6 的步骤进行,也可选择市售商品化的等效 RNA 提取试剂盒，完成 RNA 的提取。6.4.1.2 在样品处理区，取 n 个1.5 mL 灭菌离心管，其中 n 为待检样品数、2 个阳性对照管（强毒和弱毒）和 1个阴性对照 PCR 管之和，对每个管进行编号标记；6.4.1.3 取250 L 匀浆液或棉拭子保存液上清或尿囊液，加入 750 L RNA 提取试剂Trizol（6.2.1），充分混匀 15 s，再加入 200 L 预冷的三氯甲烷（6.2.2）后，盖上管盖，充分倒置混匀，静置 10 min，于 4 条件下，12 000 r/min 离心15 min；6.4.1.4 取与步骤 a)中相同数量的 1.5 mL 灭菌离心管，加入-20 预冷的异丙醇（6.2.3）600 L，对每个管进行编号。吸取步骤 b)离心后各管中的上清液转移至相应的管中，上清液至少吸取 600 L，注意不要吸出中间层，颠倒混匀；6.4.1.5 于4 条件下，12 000 r/min 离心 15 min。轻轻倾倒上清液，加入 800 L 75乙醇（6.2.5）清洗 2 次，随后瞬时离心，用无菌枪头吸尽少量残余液体，倒置于吸水纸上 3 min5 min，晾干剩余乙醇；6.4.1.6 加入 20 L 焦碳酸二乙酯（DEPC）处理水（6.2.4），轻轻混匀溶解管壁上的 RNA，2 000 r/min离心 30 s，冰上保存备用。6.4.1.7 提取的 RNA应在 2 h 内进行 RT-PCR 扩增或保存于-70 冰箱，将核酸转移至反应混合物配制区。6.4.2 阳性对照和阴性对照的设置 以灭活的鸭源禽1型副黏病毒强毒株和灭活的鸭源禽1型副黏病毒低毒力株或两者的混合物作为阳性对照，以其他禽源RNA病毒（如鸭1型肝炎病毒）或其RNA样品作为阴性对照。核酸提取方法同6.4.1。6.4.3 RT-PCR反应 样品RT-PCR检测按以下步骤进行。也可选择市售商品化的等效一步法RT-PCR试剂盒进行。每个RT-PCR反应体系为25 L。取一无RNase的离心管，配置n个（n为待检样品数和两个对照样品之和）反应管所需反应液，每个反应管的反应液配置为：依次加入14 L焦碳酸二乙酯（DEPC）处理水（6.2.4），2.5 L反转录酶缓冲液，2.5 L Taq聚合酶缓冲液，0.5 L dNTP，0.5 L Taq DNA 聚合酶，0.5 L RNA酶抑制剂，4条引物各0.5 L。准备n个RT-PCR反应管并编号，分别加入22 L前述混合液，再分别加入3 L对应样品的RNA。全部加完后，混悬，瞬时离心，使液体都沉降到PCR管底。将上述混合物按照以下步骤进行一步法RT-PCR：第一步42，30 min；第二步是PCR循环，95 预热5 min，循环参数为：94、30s，56、35 s，72、45 s，循环30次；第三步72 延伸10 min结束。6.4.4 RT-PCR产物电泳 反应结束后，各检测样品及阴、阳性对照样品均分别取5 L RT-PCR产物与0.5 L加样缓冲液混合，然后加入到1.0琼脂糖凝胶板（6.2.9）的加样孔中，随后加上DNA分子量标准；以5 V/cm的电压进行电泳，30 min40 min后在紫外凝胶成像仪中观察结果、拍照。6.4.5 结果判定 6.4.5.1 在阳性对照中，强毒株核酸模板中能扩增出 350 bp 和535 bp 大小的两个目的片段，低毒力株核酸模板中能扩增出 201 bp和 535 bp 大小的两个目的片段；强毒株和低毒力株混合物对照中，则可同时扩增出以上三种大小的目的片段。阴性对照无扩增带。在阳性对照出现相应扩增条带、阴性对照无扩增条带时判定试验有效。否则，此次试验视为无效。DB35/T 15002015 4 6.4.5.2 被检样品若同时出现 535 bp 和350 bp 两个条带（参见附录 B电泳图 2 号泳道），判定为阳性，且为强毒株。6.4.5.3 被检样品若同时出现 535 bp 和201 bp 两个条带（参见附录 B电泳图 3 号泳道），判定为阳性，且为低毒力株。6.4.5.4 被检样品若同时出现 535 bp、350 bp和 201 bp 三个条带（参见附录 B 电泳图 4 号泳道），判定为阳性，且同时存在强毒株和低毒力株。6.4.5.5 被检样品若未出现以上任一目的条带（参见附录 B 电泳图5 号泳道），则判定为阴性。DB35/T 15002015 5 A A 附 录 A（规范性附录）相关试剂的配制 A.1 样品保存液 A.1.1 0.01 M 磷酸缓冲盐溶液（PBS）NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO4.12H2O 2.9 g KH2PO4 0.2 g 将上述试剂溶于800 mL的级纯水中，完全溶解后，定容至1L，高温、高压灭菌30 min，4 保存。A.1.2 组织和咽喉棉拭子样品保存液 磷酸缓冲盐溶液（PBS）0.01 M 青霉素 2 000 IU/mL 链霉素 2 mg/mL 卡那霉素 50 g/mL 制霉菌素 1 000 IU/mL A.1.3 泄殖腔棉拭子样品保存液 磷酸缓冲盐溶液（PBS）0.01 M 青霉素 10 000 IU/mL 链霉素 10 mg/mL 卡那霉素 250 g/mL 制霉菌素 5 000 IU/mL 加入抗生素后用0.2 mol/L磷酸氢二钠调节pH值到7.07.4。A.2 焦碳酸二乙酯（DEPC）处理水 于三蒸水按0.1加入DEPC，室温静置过夜，1.034105 Pa高压20 min，冷却备用。A.3 溴化乙锭（EB）溶液 溴化乙锭 20 mg 灭菌双蒸水 加至20 mL DB35/T 15002015 6 A.4 1TAE电泳缓冲液 A.4.1 配制0.5 mol/L 乙二铵四乙酸二钠（EDTA）溶液（pH8.0）二水乙二铵四乙酸二钠 18.61 g 氢氧化钠 调pH至8.0 灭菌双蒸水 加至100 mL A.4.2 配制50TAE电泳缓冲液 羟基甲基氨基甲烷（Tris）242 g 冰乙酸 57.1 mL 0.5 mol/L 乙二铵四乙酸二钠溶液（pH8.0）100 mL 灭菌双蒸水 加至 1 000 mL 用时用灭菌双蒸水稀释50倍使用。A.4.3 配制1TAE电泳缓冲液 50TAE 电泳缓冲液 20 mL 灭菌双蒸水 加至 1 000 mL A.5 1.0琼脂糖凝胶 琼脂糖 1.0 g 1TAE 电泳缓冲液 加至 100 mL 微波炉中完全融化，待冷至50 60 时，加溴化乙锭（EB）溶液5 L，摇匀后倒入制胶板中，凝固后取下梳子，备用。A.6 10加样缓冲液 聚蔗糖 25 g 灭菌双蒸水 100 mL 溴酚蓝 0.1 g 二甲苯青 0.1 g DB35/T 15002015 7 B B 附 录 B（资料性附录）PCR扩增引物序列 B.1 PCR扩增引物 PCR扩增引物见表B.1。引物扩增片段大小：引物对APMVF47与APMVR396为强毒株特异性引物，扩增产物大小为350 bp的片段；引物对APMVF381与APMVR581为低毒力株特异性引物，扩增产物大小为201 bp的片段；引物对APMVF47与APMVR581扩为禽1型副黏病毒通用引物，扩增产物大小为535 bp的片段。表B.1 PCR扩增引物 引物名称 引物序列*APMVF46 5-ATGGGCYCCARAYCTTCTAC-3 APMVR396 5-AGCGTYTTTGTCTCCT-3 APMVF381 5-GGGGARACAGGGDCGYC-3 APMVR581 5-CTGCCACTGMTAGTTGTGATAATCC-3*序列中含有的简并碱基D=A/T/G，Y=C/T，R=A/G，M=A/C B.2 PCR检测结果电泳图 鸭（鹅）禽1型副黏病毒病PCR检测结果电泳图见图B.1。说明：1DNA分子量标尺；2强毒株扩增结果；3低毒力株扩增结果；4强毒株、低毒力株混合物扩增结果；5阴性对照。图B.1 PCR检测结果电泳图 DB35/T 15002015 福建省地方标准 水禽禽 1型副黏病毒病诊断技术 DB35/T 15002015*2015年 3月第一版 2015年 3月第一次印刷