饲料中恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星的测定液相色谱-串联质谱法DB22／T 1997-2014.pdf

ICS 65.120 B 46 DB22 吉林省 地方标准 DB 22/T 1997 2014 饲料中恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星的测 定 液相色谱-串联质谱法 Determination of enrofloxacin，ciprofloxacin，norfloxacin in feeds LC-MS/MS method 2014-02-28发布 2014-04-30实施 吉林省质量技术监督局 发布 DB22/T 1997-2014 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009和 GB/T 20001.4-2001给出的规则起草。本标准由吉林省质量技术监督局提出并归口。本标准起草单位：吉林省产品质量监督检验院、吉林大学。本标准主要起草人：李媛媛、刘斌、李滢倩、关树文、刘智、任明月、王颖。DB22/T 1997-2014 1 饲料中恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星的测定 液相色谱-串联质谱法 1 范围 本标准规定了饲料中恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星的液相色谱-串联质谱测定。本标准适用于饲料中恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星的含量测定。本标准方法检出限为 10 g/kg。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是 注日期 的 引 用文件，仅所注日期 的 版 本适用于本文 件。凡是不 注日期 的 引 用文件，其最新版 本（包括所有 的 修改 单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实 验 室 用 水 规 格 和 试 验方法 GB/T 20195 动物 饲料 试样 的 制备 3 原理 用 乙腈 和 磷酸盐缓冲溶 液提 取试样 中恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星，固 相 萃取小柱净化，5%氨水甲醇溶 液 洗脱，供 液相色谱-串联质谱检测，外 标法定量。4 试剂与材料 所有试剂，如未注 明规 格，均指分析纯；除另有说 明 外，水 为 GB/T 6682规定的 一级水。4.1 甲醇，色谱 纯。4.2 乙腈，色谱 纯。4.3 磷酸。4.4 甲酸，色谱 纯。4.5 磷酸氢二钠（Na2HPO4.12H2O）。4.6 磷酸二氢钾（KH2PO4）。4.7 氨水。4.8 磷酸盐缓冲溶 液：称取 5.68 g磷酸氢二钠(4.5)和 1.36 g磷酸二氢钾(4.6)置 于 1000 mL烧杯 中，加入 800 mL水溶解，用 磷酸（4.3）调至 pH=3.0，再 用 水 定 容至 1000 mL。4.9 氨水甲醇溶 液(5%)：取 5 mL氨水(4.7)与 95 mL甲醇(4.1)混合。DB22/T 1997-2014 2 4.10 甲酸水溶 液(pH=3.0)：量 取 500 mL水，用 甲酸（4.4）调 pH值到 3.0。4.11 甲醇水溶 液(25%)：取 250 mL甲醇(4.1)，加水稀释到 1000 mL。4.12 甲醇-甲酸溶 液(15+85)：量 取 30 mL甲醇(4.1)与 170 mL甲酸溶 液(4.9)混合。4.13 恩诺沙星(CAS：93106-60-6)、环丙沙星(CAS：93107-08-5)、诺氟沙星(CAS：70458-96-7)标准物 质，纯度 大于 等 于 95%。4.14 标准 贮备 液(1.0 mg/mL)：称取 0.1 g（精确至 0.1 mg）标准 物 质(4.13)，至 100 mL容 量 瓶，甲醇(4.1)定 容。2-4 冷藏保 存，可 保 存 6个 月。4.15 混合 标准 工作 液(1 g/mL)：用 甲醇水溶 液(4.11)分 别配成浓 度 范围 为 1ng/mL-60ng/mL标准 工作 溶 液，现配。4.16 Oasis HLB固 相 萃取小柱 或 相 当者：60mg，3mL。4.17 滤膜：0.22 m。4.18 氮气。5 仪器 5.1 液相色谱-质谱联用 仪：配 有 电喷雾电离源。5.2 涡旋振荡器。5.3 固 相 萃取 装 置。5.4 分析 天平：感 量 0.1 mg。5.5 粉碎机。5.6 旋转蒸发仪。5.7 氮气吹干仪。5.8 离心机。6 试样制备 选 取 代表性 饲料 样 品 至 少 500 g，按照 GB/T 20195制备试样。7 分析步骤 7.1 提取 称取试样 0.5 g(精确至 0.1 mg)于 50 mL具塞离心管 中，准 确加入 6 mL磷酸盐缓冲溶 液(4.8)，涡旋 混 匀，再加入 10 mL乙腈(4.2)，于 涡旋振荡器振荡 提 取 1 min，5000 r/min离心 5min，上清 液 过滤 到 鸡心 瓶 中，在残渣 中 加入 5 mL磷酸盐缓冲溶 液(4.8)，10 mL乙腈(4.2)，重复以上步骤，合 并 上清 液，于 50 旋转蒸发，至乙腈 全部蒸 出。加入 5 mL磷酸盐缓冲溶 液(4.8)，混 匀。DB22/T 1997-2014 3 7.2 净化 固 相 萃取小柱 先 用 5 mL甲醇、5 mL水 和 5 mL磷酸盐缓冲溶 液(4.8)活 化，保 持 柱 体湿润。将 7.1的 样液 以 1 mL/min的 流速全部过 HLB固 相 萃取小柱，待 液 体完全流 出 后，先后以 4 mL水，4 mL甲醇水溶 液(4.11)淋 洗，抽干，用 4 mL氨水甲醇溶 液(4.9)洗脱 于 10 mL具刻 度 离心管 中，洗脱 液于 50，氮吹 至 约0.2 mL时停止浓缩，用 甲醇-甲酸溶 液(4.12)定 容至 1 mL，5000 r/min离心 5 min,过 0.2 m滤膜，供 液相 色谱串联质谱 分析。7.3 液相色谱-串联质谱测定 7.3.1 参考条件 a)色谱 柱：C8柱 1(50mm 2.1 mm(i.d)，5 m)，或 其 他 等 效 柱；b)色谱 柱 温 度：30；c)流速：0.2 mL/min；d)进 样 体积：5 L；e)流 动 相 比例：乙 睛：0.1%甲酸溶 液（15:85）。7.3.2 MS/MS参考条件 a)离子源：电喷雾（ESI），正离子模式；b)离子喷雾电 压：4 kV；c)雾 化 气：氮气，0.25 MPa；d)干 燥 器：氮气，流速 10 L/min，温 度 325；e)扫描 方 式：多反 应监测（MRM）；f)监测 离子：检测 离子 见 表 1；g)驻留 时 间：0.2 s；h)脱溶剂 气、锥孔 气 为 氮气，碰撞 气 为 高 纯 氮气；使 用 前 应 调 节各 气体流 量 以 使 质谱 灵敏 度 达 到 检测要 求；锥孔 电 压、碰撞能 量 等 电 压 值 应 优 化至最 优灵敏 度。表 1 被测物的母离子和子离子参数表 化合物 中文 名 称 化合物 英 文 名 称 CAS号 定 性离子 对 定量 离子 对 恩诺沙星 enrofloxacin 93106-60-6 360/316 360/342 360/316 环丙沙星 ciprofloxacin 93107-08-5 332/314 332/231 332/314 诺氟沙星 norfloxacin 70458-96-7 320/302 320/231 320/302 7.3.3 定性分析 按照 上 述条 件测定 试样 和标准 工作 溶 液，如 果 试样 中的质量色谱 峰 保 留 时 间 与 标准 工作 溶 液 一 致（变 化 范围在 2.5%之内）；试样 中 目 标 化合物 的 两 个子离子 的相对 丰 度与 浓 度 相 当 标准 溶 液的相对 丰 度一 致，相对 丰 度 偏差 不 超 过表 1的规定，则可 以 判断 试样 中 存在待 测 组 分。DB22/T 1997-2014 4 表 2 定性离子相对丰度的最大允许偏差 7.3.4 定量分析 在仪器 最 佳 工作 条 件下，对标准 溶 液 进 样，以 峰面 积 为 纵坐 标，标准 溶 液 浓 度 为 横坐 标 绘 制 标准 工作 曲线，用标准 工作 曲线 对 样 品 进 行 定量，样 品 溶 液中 待 测 物 的 响 应 值均 应 在仪器 测定的 线 性范围 内。标准品 多反 应监测色谱 图参见附录 A中 图 A。8 结果计算 测定 结果 可由 计算 机 自 动 计算 待 测 组 分 的含量，也 可按 式（1）计算：10001000cVWm=.(1)式 中：W 试样 中 被 测 组 分 的含量，单位为 微克每千克（g/kg）；c 由标准 曲线查得 试 液中 被 测 组 分 的 浓 度，单位为 微克每升（g/L）；V 试样 定 容 体积，单位为 毫升（mL）；m 试样取样 质量，单位为 克（g）。9 精密度 在重复性 条 件下，获得 的 两次独立 测 试 结果 的 绝 对 差 值 不 超 过 算 术 平 均值 15%。在 再 现性 条 件下，获得 的 两次独立 测 试 结果 的 绝 对 差 值 不 超 过 算 术 平 均值 15%。相对 离子 丰 度 50%20%至 50%10%至 20%10%允许 的相对 偏差 20%25%30%50%DB22/T 1997-2014 5 A A 附 录 A（资 料性附 录）MRM质量色谱谱 图 图 A.1 三种 被测物 混合 标准 溶 液 总 离子 流图（1.0 mg/L）图 A.2 诺氟沙星的 MRM色谱 图（1.0 mg/L）DB22/T 1997-2014 6 图 A.3 环丙沙星的 MRM色谱 图（1.0 mg/L）图 A.4 恩诺沙星的 MRM色谱 图 _