饲料中肉毒梭菌测定 PCR方法DB22／T 2051-2014.pdf

ICS 07.100.30 B 20 DB22 吉林省 地方标准 DB 22/T 2051 2014 饲料中肉毒梭菌测定 PCR方法 Determination of Clostridium botulinum in feedstuffs PCR method 2014-02-28发布 2014-04-30实施 吉林省质量技术监督局 发布 DB22/T 2051 2014 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009和 GB/T 20001.4-2001给出的规则起草。本标准由吉林省质量技术监督局提出并归口。本标准主要起草单位：吉林省产品质量监督检验院、国家农业深加工产品质量监督检验中心、中华人民共和国吉林出入境检验检疫局、中华人民共和国顺德出入境检验检疫局。本标准主要起草人：史艳宇、刘金华、邵秋荣、刘斌、周亮、刘晓晖、王潇、任明月。DB22/T 2051 2014 1 饲料中肉毒梭菌测定 PCR方法 1 范围 本标准规定了饲料中肉毒梭菌的 PCR检验方法。本标准适用于饲料中 A、B、E、F型肉毒梭菌的快速筛选检测。2 规范性引用文件 下 列文件对 于本 文件 的 应 用 是必不可少 的。凡是注日期 的 引 用 文件，仅所注日期 的 版 本适用于本 文 件。凡是不注日期 的 引 用 文件，其最新版 本（包括所有 的 修改 单）适用于本 文件。GB/T 6682 分析实 验 室 用 水 规 格 和 试 验方法 GB/T 27403 实 验 室 质量 控制 规 范 食 品 分子生物学 检测 3 术语和定义 下 列 术 语 和定 义 适用于本 文件。3.1 肉毒梭菌 clostridium botulinum 肉毒梭菌 为 梭菌 科 梭菌 属革兰氏阳性芽孢杆 菌，厌氧，在 适 宜 的 培养基及特 定的 环 境 条件 下产 生一类具有很强 毒 性 的 神经麻痹 毒 素，即 肉毒毒 素。4 原理 样 品 增 菌 后，培养物经 DNA提 取制备 PCR模板，进行 PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳 检测 PCR产 物是 否 有特 征 条 带，从而 对 饲料中 是 否污染 肉毒梭菌 进行 快速检验。5 试剂 除 特 别说 明 以外，所有试 剂均 为分析 纯，水为 按照 GB/T 6682规定的 一 级 水。所有试 剂均 用 无 DNA酶污染 的 容器 分 装。5.1 引物：见表 1。DB22/T 2051 2014 2 表 1 引物序列 目 标菌 类 型 引物 序 列 扩增 长度 bp 上游 引物：5-GTG ATA CAA CCA GAT GGT AGT TAT AG-3 A型 下 游 引物：5-AAA AAA CAA GTC CCA ATT ATT AAC TTT-3 983 上游 引物：5-GAG ATG TTT GTG AAT ATT ATG ATC CAG-3 B型 下 游 引物：5-GTT CAT GCA TTA ATA TCA AGG CTG G-3 492 上游 引物：5-CCA GGC GGT TGT CAA GAA TTT TAT-3 E型 下 游 引物：5-TCA AAT AAA TCA GGC TCT GCT CCC-3 410 上游 引物：5-GCT TCA TTA AAG AAC GGA AGC AGT GCT-3 F型 下 游 引物：5-GTG GCG CCT TTG TAC CTT TTC TAG G-3 1 137 5.2 疱 肉 培养基：见附录 A.1章。5.3 胰蛋白胨葡萄 糖 酵母浸膏 肉 汤（TPGY）：见附录 A.2章。5.4 厌氧 卵黄 琼脂：见附录 A.3章。5.5 细 菌 基 因组 DNA提 取 纯化 试 剂盒。5.6 Taq DNA聚合酶。5.7 dNTP：dATP（deoxyadenosine triphosphate，脱 氧 腺苷三磷酸）、dGTP（deoxyguanosina triphosphate，脱 氧 鸟苷三磷酸）、dCTP（deoxycytidine triphosphate，脱 氧 胞苷三磷酸）、dTTP（deoxythymidine triphosphate，脱 氧 胸苷三磷酸）。5.8 溶 菌 酶。5.9 蛋白酶 K。5.10 无 水 乙醇。5.11 十二烷 基 硫酸钠（SDS）。5.12 蔗 糖。5.13 三羟甲 基 氨 基 甲烷（Tris）。5.14 乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA-Na2 2H2O）。5.15 10 PCR缓冲液：含 200 mmol/L Tris-HCl（pH8.4），200 mmol/L氯化钾（KCl），15 mmol/L氯化镁（MgCl2）。5.16 分子 量标 记：100 bp3 000 bp DNA Marker。5.17 琼脂糖：电泳 级。5.18 溴化乙锭。5.19 EDTA溶液，0.5 mol/L，pH8.0：称 取 186.1 g EDTA-Na2 2H2O，加入 700 mL去离 子水 中，在 磁力搅拌器上剧烈搅拌，用 10 mol/L氢 氧 化钠 调 pH值至 8.0，用 水 定 容 到 1 L，分 装 后 高压灭 菌。5.20 Tris-HCl，1 mol/L，pH8.0：在 800 mL去离 子水 中 溶 解 121.1 g Tris，冷却至 室 温 后 用 浓 盐酸 调节 溶液 的 pH值至 8.0，加 水 定 容 至 1 L，分 装 后 高压灭 菌。5.21 TE缓冲液（pH8.0）：在 800 mL水 中，依次 加入 10 mL的 1 mol/L Tris-HCl（pH8.0）和 2 mL的 0.5 mol/L EDTA（pH8.0），用 水 定 容 到 1 L，分 装 后 高压灭 菌。5.22 溶 菌 酶溶液：用 TE配 制，使 用 浓 度 为 10 mg/mL。5.23 蛋白酶 K溶液：用 高压灭 菌的 去离 子水 溶 解 蛋白酶 K为 10 mg/mL的 溶液，分 装 后 于-20 保存，避免反复冻融。5.24 20%SDS溶液：将 20 g SDS溶 解 在 100 mL去离 子水 中。DB22/T 2051 2014 3 5.25 50 TAE电泳 缓冲液（储 备 液）：称 取 484 g Tris，量 取 114.2 mL冰醋 酸，200 mL 0.5 mol/L EDTA溶液（pH8.0），溶 于 水 中，定 容 至 2 L。分 装 后 高压灭 菌 备 用。使 用 前稀释成 1 TAE电泳 缓冲液（工 作 液）。5.26 加 样 缓冲液：称 取 溴 酚蓝 250 mg，加 水 10 mL，在室 温 下 过夜 溶 解；再 称 取 二甲 腈蓝 250 mg，用 10 mL水 溶 解；称 取 蔗 糖 50 g，用 30 mL水 溶 解，合 并 三 种 溶液，用 水 定 容 至 100 mL，在 4 保存。5.27 阳性对 照：含 有扩增 片段 的质 粒或 A、B、E、F型肉毒梭菌的 基 因组 DNA。6 仪器和设备 6.1 厌氧培养 装 置。6.2 生物 安全柜：AII型。6.3 恒温 培养 箱：35 1 和28 1。6.4 高压灭 菌 器。6.5 高 速 冷冻 离 心 机：转 速 12 000 r/min。6.6 PCR仪。6.7 电泳 仪。6.8 凝胶 成像 分析 系统。6.9 核 酸蛋白 分析 仪或紫 外 分 光光 度 计。6.10 恒温 水 浴锅。6.11 天平：感 量 0.1 g。6.12 均 质 器 或灭 菌 研钵。6.13 微 量 移 液器：0.2 L 2 L、2 L 10 L、20 L 200 L、100 L 1 000 L。6.14 离 心 管：1.5 mL。7 检测 7.1 样品制备与增菌培养 样 品 经 均 质 处理 后及 时接种 培养。接种前，先将 增 菌 培养基 煮沸 10 min15 min，以 排 除溶 解 于 培养基 中的 氧，并 迅 速 冷却，切勿摇动。每 15 mL增 菌肉 汤 中 接种 1 g2 g样 品，接种时将接种 物 慢慢接 入肉 汤液 面 以 下。每份 样 品 接种两管 疱 肉 培养基，置 35 1，同时接种两管 TPGY培养基，置 28 1，厌氧培养 5 d。检 查 培养物 的 浊 度、产 气、肉 粒 的 消 化 和产 生 的 气味。若 有生 长，按 7.2分 离纯 培 养物。若未 见 生 长，可 再 培养 10 d。7.2 分离纯培养物 取 1 mL 2 mL培养 液 置 于 螺旋帽 试 管 中，加入 等 量 过 滤 除 菌的 无 水 乙醇。混匀，在室 温 下 放 置 1 h。或 80 加 热 10 min 15 min以 破坏 其 繁殖体。用 接种 环取 1环 2环经 乙醇 或 加 热 处理 的 培养物在厌氧 卵黄 琼脂 上 划线 接种，置 厌氧条件 下 35 1 培养 48 h。挑 取 约 10个 单 个 的 典 型菌 落。肉毒梭菌的菌 落 为 隆 起 或 扁 平，光 滑 或 粗糙，容 易蔓延 生 长 并 有不 规 则 边缘。在 卵黄 培养基 上 用 斜射 光 检 查时，菌 落 表 面 通常呈虹彩 样，亦 称 为 珠色层。彩 带 通常向 外 延伸，继 而 菌 落 产 生不 规则 外 形。接种 可 疑 菌 落 到 TPGY培养基 中，置 35 1 厌氧培养 24 h。DB22/T 2051 2014 4 培养 液 一 部 分 用于 DNA提 取，剩余 培养 液 置 于 4 保存，以 备 确证 试 验 使 用。7.3 DNA提取 取 1.4 mL TPGY培养物 转移至 1.5 mL离 心 管 中，12 000 r/min离 心 2 min，弃 去上 清 液。菌 体沉淀 用 1.0 mL TE缓冲液 洗 两次 后 重悬 于 120 L的 25%蔗 糖 溶液 中。加入 10 mg/mL溶 菌 酶溶液 120 L，混匀，37 1 水 浴 30 min；然 后 加入 20%SDS溶液 30 L，轻轻混匀，室 温 放 置 5 min；再 加入 10 mg/mL蛋白酶 K溶液 9.0 L，混匀 后 37 1 水浴 30 min。悬浮 液 采 用 细 菌 基 因组 DNA提 取 纯化 试 剂盒 并按 试 剂盒说 明 书 进行 操 作。提 取 的 DNA溶液 可 于-20 保存。7.4 DNA浓度测定 取 10 L DNA溶液 加 蒸馏 水 稀释至 1 mL，使 用 核 酸蛋白 仪或紫 外 分 光光 度 计 分 别 检测 260 nm和 280 nm处 的 吸 光值。DNA的 浓 度 按照 式（1）计 算，当 A260/A280比 值 在 1.5 2.1之间 时，适 宜 于 PCR扩增。扩 增 前将 所有样 品 DNA调至 10 ng/L 50 ng/L。501000ANc=.(1)式 中：c DNA浓 度，单位 为 纳克 每微 升（ng/L）；A 260 nm处 的 吸 光值；N 核 酸 稀释 倍数。7.5 PCR检验 7.5.1 PCR反应体系 10 PCR缓冲液 2.5 L、dNTP(10 mmol/L)0.5 L、上 下 游 引物（10 mol/L）各 1 L、Taq DNA聚合 酶(5 U/L)0.25 L、DNA 模板（10 ng/L 50 ng/L）2 L、用 无 菌 去离 子水 补足体积 至 25 L。针 对 A、B、E、F型肉毒梭菌，进行 多个 PCR扩增，每 个 PCR反 应 管 检测 一 种 类 型的肉毒梭菌。7.5.2 反应条件 95 预变 性 5 min，94 变 性 1 min，60 退火 1 min，72 延伸 1 min，40个循 环，72 后 延伸 10 min。结束 反 应，4 保存。不 同仪 器、不 同 Taq DNA聚合酶 可 根据 要 求 将反 应条件 做 适 当 调 整。检验 过 程 中 分 别 设空 白 对 照、阴 性对 照、阳性对 照。空 白 对 照 设 为 以无 菌 水 代替 DNA模板；阴 性 对 照 采 用 非 肉毒梭菌的 DNA作 为 PCR反 应 的 模板；阳性对 照 采 用 含 有扩增 片段 的质 粒或 A、B、E、F型 肉毒梭菌的 基 因组 DNA作 为 PCR反 应 的 模板。7.5.3 扩增产物电泳检测 取 1.2 g 1.5 g琼脂糖，于 100 mL电泳 缓冲液 中加 热，充 分 熔 化，加入 溴化乙锭 贮 存 液 至 终 浓 度 为 0.5 g/mL，制胶。在电泳 槽 中加入 电泳 缓冲液，使 液 面 刚刚没 过 凝胶。将 5 L 8 L PCR扩增 产 物分 别和适量加 样 缓冲液 混 合，点 样，用 分子 量标 记 作 参 照。9 V/cm恒压 电泳，直 至 溴 酚蓝 指示 剂 迁 移至 凝胶 中 部，电泳 检测 结果 用 凝胶 成像 分析 系统 记录 并 保存。8 结果判定 DB22/T 2051 2014 5 8.1 阴 性对 照和 空 白 对 照 均 未 出 现 条 带，阳性对 照出 现 预 期 大小 的 扩增条 带，待 测 样 品出 现 预 期 大小的 扩增条 带，判 定 为 PCR结果 阳性，按 附录 B进行 确证 试 验。8.2 阴 性对 照和 空 白 对 照 均 未 出 现 条 带，阳性对 照出 现 预 期 大小 的 扩增条 带，待 测 样 品 未 出 现 预 期 大 小 的 扩增条 带，判 定 为 PCR结果阴 性，可 直 接 报告。8.3 实 验中 设 置 的 阴 性对 照、空 白 对 照和 阳性对 照 PCR检测 结果 应 符 合上 述情况。否 则，任 一 种 对 照 如果 出 现非 上 述正 常 结果，应 重 做 试 验。9 结果表述 9.1 PCR结果阴 性，直 接 报告“未 检出 A、B、E、F型肉毒梭菌”。9.2 确证 试 验 结果 为 检出肉毒梭菌，则 报告“检出 A、B、E、F型肉毒梭菌”。9.3 确证 试 验 结果 为 未 检出肉毒梭菌，则 报告“未 检出 A、B、E、F型肉毒梭菌”。10 生物安全措施 为 了 保 护 实 验 室 人 员 的 安全，应 由 具备 资 格 的工 作 人 员 检测，所有培养物应 小 心 处置，并按 GB/T 27403中的 有 关 规定 执 行。11 废弃物处理和防止污染的措施 11.1 检验 过 程 中的 废 弃 物 需 经 121 高压灭 菌 处理至 少 30 min后 再 弃 置。11.2 检验 过 程 中 防止交叉 污染 的 措施 按 GB/T 27403执 行。DB22/T 2051 2014 6 A A 附 录 A（规范性附录）培养 基 和试剂 A.1 疱 肉培养 基 A.1.1 成 分：a)新 鲜牛 肉 500.0 g b)蛋白胨 30.0 g c)酵母浸膏 5.0 g d)磷酸二 氢 钠 5.0 g e)葡萄 糖 3.0 g f)可 溶 性 淀 粉 2.0 g g)蒸馏 水 1 000 mL A.1.2 制法 将 新 鲜 除 脂 肪 和 筋膜 的 牛 肉 500 g切 碎，加入 蒸馏 水。加 热 至沸 点，再 以 文 火 煮 1 h。充 分 冷却，经 纱布 过 滤，挤 出 余 液。加入 其 他 成 分，用 蒸馏 水 将 液 体体积补足 至 1000 mL。调节 pH至 7.4 0.1，经 粗滤 纸 过 滤。在 15 mm 150 mm试 管 中加入 碎 肉 渣 至 3 cm高，然 后 加入肉 汤，超 过 肉 渣 表 面 约 4 cm，上 面 覆盖 一 层 液 体 石蜡，厚 度 为 0.3 cm 0.4 cm。在 121 高压灭 菌 20 min。A.2 胰蛋白胨葡萄糖酵母浸膏 肉 汤（TPGY）A.2.1 成 分：a)胰 酪 胨（trypticase）50.0 g b)蛋白胨 5.0 g c)酵母浸膏 20.0 g d)葡萄 糖 4.0 g e)硫乙醇酸 纳 1.0 g f)蒸馏 水 1 000 mL A.2.2 制法 将 固 体 成 分 溶 于 1 000 mL蒸馏 水 中，再 分 装 15 mm 150 mm试 管，每管 15 mL。上 面 覆盖 一 层 液 体石蜡，厚 度 为 0.3 cm 0.4 cm。在 121 高压灭 菌 10 min。最 终 pH为 7.0 0.1。放 冰箱 内 保存，若 2周 内 不 用则 弃 掉。临 用 前，将 基 础 液 用 蒸 汽 或煮沸 加 热 10 min 15 min，以 排 除游离 氧，迅 速 冷却。A.3 厌氧卵黄琼脂 A.3.1 琼脂基础 DB22/T 2051 2014 7 a)酵母浸膏 50.0 g b)胰胨 5.0 g c)蛋白胨 20.0 g d)氯化钠 5.0 g e)琼脂 20.0 g f)蒸馏 水 1 000 mL 在 121 下 高压灭 菌 15 min。最 终 pH为 7.0 0.2。A.3.2 卵黄乳状液 用 硬刷 洗 涮 2个 3个 鸡 蛋，沥干。将 鸡 蛋 放 在 0.1%氯化 汞 溶液 中 浸 泡 1 h，再 用 70%乙醇浸 泡 30 min。取 出 鸡 蛋，以无 菌 操 作 打开，弃 去蛋白。用 注 射 器 取 出 蛋黄，放 入 灭 菌 容器，加 等 量 灭 菌 生 理 盐 水，充 分 混 合，存 于 4 备 用。A.3.3 制法 每 500 mL琼脂基 础 液（48 50）加 80 mL卵黄 乳状 液，充 分 混 合，制 成平 板。室 温 放 置 2 d，或 35 放 置 24 h。剔 除污染 的 平 板，将 无 菌 平 板 存 于 冰箱。DB22/T 2051 2014 8 B B 附 录 B（规范性附录）确证 试验 B.1 试剂 B.1.1 明 胶 磷酸盐缓冲液：明 胶 2 g，磷酸 氢 二钠 4 g，蒸馏 水 1 000 mL。将 上 述 成 分 加 热 溶 解，调 pH至 6.2，121 高压灭 菌 15 min。B.1.2 肉毒 分 型 抗 毒 诊断 血 清。B.1.3 胰酶：活 力 1：250。B.2 设备 B.2.1 灭 菌 注 射 器：1 mL。B.2.2 小 白 鼠：12 g15 g。B.3 操作步骤 取 7.2剩余 培养 液，离 心，取一 部 分 上 清 液 直 接 进行 毒 素 检测 试 验，另 取一 部 分 上 清 液，调 pH6.2，每 9份 加 10%胰酶（活 力 1:250）水 溶液 一 份，混匀，不 断 轻轻 搅 动，37 作 用 60 min，进行 毒 素 检测 试验。B.3.1 检 出 试验：取 上 述 离 心 上 清 液 及其 胰酶 激活 处理 液 分 别 注 射 小 白 鼠 三 只，每 只 0.5 mL，观察 4 d。注 射 液 中 若有 肉毒毒 素 存 在，小 白 鼠 一 般 多 在注 射 后 24 h内 发病、死亡。主要 症 状 为 竖毛、四 肢瘫软，呼 吸 困难，呼 吸呈 风 箱 式，腰 部 凹陷，宛 若 蜂腰，最 终 死 于 呼 吸 麻痹。如 遇 小 鼠猝死 以 至 症 状 不 明 显 时，则 可 将 注 射 液 做 适 当 稀释，重 做 试 验。B.3.2 确证 试验：不 论 上 清 液 或 其 胰酶 激活 处理 液，凡 能致 小 鼠发病、死亡者，取样分 成 三 份 进行试 验，一 份 加 等 量多 型 混 合 肉毒 抗 毒 诊断 血 清，混匀，37 作 用 30 min，一 份 加 等 量明 胶 磷酸盐缓冲液，混匀，煮沸 10 min；一 份 加 等 量明 胶 磷酸盐缓冲液，混匀 即可，不 做 其 他 处理。三 份 混 合液 分 别 注 射 小 白 鼠 各 两 只，每 只 0.5 mL，观察 4 d，若 注 射 加 诊断 血 清 与 煮沸 的 两份 混 合液 的 小 白 鼠 均 获 保 护 存 活，而 唯 有注 射未 经其 他 处 理 的 混 合液 的 小 白 鼠 以 特有 的 症 状 死亡，则 可 判 定检 样 中的肉毒毒 素 存 在。_