脱毒甘薯种薯（苗）病毒检测技术规程DB41／T 987-2014.pdf

ICS 65.020 B 16 DB41 河南省地方标准 DB41/T 9872014 脱毒甘薯 种薯（苗）病毒检 测技术规 程 Technical criterion for virus detection of virus-free sweet potato seed tuber or seedling 2014-12-30 发布 2015-03-01 实施 河南省质量技术监督局 发布 DB41/T 987 2014 I 目 次 前言.II1 范围.12 术语和 定义.12.1 脱毒 组培 苗.12.2 扩繁 苗.12.3 脱毒 种薯（苗）.12.4 原原 种.12.5 原种.12.6 大田 用种.12.7 允许 带毒 率.22.8 允许 病毒 显症 率.23 检测对 象.24 抽样.24.1 组培 苗抽 样.24.2 田间 抽样.25 检测方 法.25.1 硝酸 纤维 素膜 酶联 免疫吸附 测定（NCM-ELISA）检测法.25.2 指示 植物 检测 法.35.3 聚合 酶链 式反 应（PCR）检 测法.35.4 反转 录聚 合酶 链式 反应（RT-PCR）检 测法.36 脱毒种 薯（苗）的检 测程序及 质量 要求.36.1 脱毒 组培 苗.36.2 原原 种.36.3 原种.36.4 大田 用种.3附录A（规 范性 附录）硝 酸纤维 素膜 酶联 免疫 吸附 测定（NCM-ELISA）检测 法.4附录B（规 范性 附录）指示植物 检测 法.6附录C（规 范性 附录）聚 合酶链 式反 应（PCR）检 测法.7附录D（规 范性 附录）反转录聚 合酶 链式 反应（RT-PCR）检测 法.9 DB41/T 987 2014 II 前 言 本标准 按照GB/T 1.1-2009 给出的 规则 起草。本标准 由河 南省农业 科学 院提出。本标准 起草 单位：河 南省 农业科 学院 植物 保护 研究 所。本标准 主要 起草 人：张振 臣、乔 奇、秦艳 红、张德 胜、王 爽、田雨 婷、王永 江。DB41/T 987 2014 1 脱 毒甘薯 种薯（苗）病毒 检测技术 规程 1 范围 本标准 规定 了脱 毒甘 薯种 薯（苗）病毒 检测 的术 语定 义、检 测对 象、抽 样、检 测 方法和 脱毒 种薯（苗）的检测 程序 及 质量要 求。本标准 适用 于脱 毒甘 薯种 薯（苗）的 病毒 检测。2 术语和 定义 下列术 语和 定义 适用 于本 文件。2.1 脱毒组 培苗 virus-free tissue culture seedling 利用茎 尖分 生组 织培 养技 术获得 的再 生组 培苗，经检 测，确认 不含 甘薯 羽状 斑驳 病毒（Sweet potato feathery mottle virus，SPFMV）、甘 薯潜 隐病 毒（Sweet potato latent virus，SPLV）、甘薯 G 病毒（Sweet potato virus G，SPVG）、甘薯病 毒 2（Sweet potato virus 2，SPV2）、甘薯褪 绿斑 病毒（Sweet potato chlorotic fleck virus，SPCFV）、甘薯 褪绿 矮化病 毒（Sweet potato chlorotic stunt virus，SPCSV）和 甘薯 卷叶 病毒（Sweet potato leaf curl virus，SPLCV）的种 苗。2.2 扩繁 苗 propagation seedling 由脱毒 组培 苗在 无菌 条件 下或者 防虫 温（网）室内 快繁后 得到 的甘 薯苗。2.3 脱毒种 薯（苗）virus-free seed tuber or seedling 由脱毒 组培 苗经 逐代 繁殖 增加种 薯（苗）数 量的 种 薯（苗）生产 体系 生产 出 来的种 薯（苗）。分原原种、原种、大 田用 种三 个级别。2.4 原原 种 pre-elite 用脱毒 组培 苗或 扩繁 苗在 防虫网 室内 生产 出的 符合 质量要 求的 种薯（苗）。2.5 原种elite 用原原 种作 种薯，在 隔离 条件下 生产 出的 符合 质量 要求的 种薯（苗）。2.6 大田用 种certified seed 用原种 作种 薯，在隔 离条 件下生 产出 的符 合质 量要 求的种薯（苗）。2.7 允许带 毒率 permission virus-carrying rate 各级甘 薯种 薯（苗）繁殖 田中允 许携 带病 毒植 株的 比率。2.8 允许病 毒显 症率 permission virus-symptom rate DB41/T 987 2014 2 各级甘 薯种 薯（苗）繁殖 田中允 许出 现病 毒病 症状 植株的 比率。3 检测对 象 甘薯羽 状斑 驳病 毒（SPFMV）；甘薯潜 隐病 毒（SPLV）；甘薯G 病毒（SPVG）；甘薯病 毒2（SPV2）；甘薯褪 绿斑 病毒（SPCFV）；甘薯褪 绿矮 化病 毒（SPCSV）；甘薯卷 叶病 毒（SPLCV）。4 抽样 4.1 组培苗 抽样 4.1.1 脱毒组 培苗 每株均 应检 测。4.1.2 扩繁苗 随机抽 取1%2%的扩 繁苗 检测。4.2 田间抽 样 4.2.1 原原种 田抽 样 定植后30 d、60 d、收获 前2周，在目测 的基 础上，采用五 点取 样法。面积 0.1 hm2，抽取 数量 为200株；0.1 hm2面积 1 hm2，抽取 数量 为500 株；每超出1 hm2面积，划出 另一检验 区，按本 规程 规定的面积 取样。每 株取 上、中、下 部叶 片1 g5 g，-20 以下 低温 保存。4.2.2 原种田 和大 田用 种田 抽样 定植后30 d、收 获前 两周，在目 测的 基础 上，采用 五点取 样法。取 样方 法及 样品保 存同4.2.1。5 检测方 法 5.1 硝酸纤 维素 膜酶 联免 疫吸 附测定（NCM-ELISA）检 测法 用于检 测SPFMV、SPLV、SPVG、SPV2、SPCFV、SPCSV 和SPLCV共7 种病 毒，检测 法见附 录A。5.2 指示植 物检 测法 用于辅 助检 测SPFMV、SPLV、SPVG、SPV2、SPCFV、SPCSV 和SPLCV 共7 种病 毒，检测 法见 附录B。5.3 聚合酶 链式 反应（PCR）检测法 用于检 测SPLCV。检 测 法见附录C。DB41/T 987 2014 3 5.4 反转录 聚合 酶链 式反 应（RT-PCR）检 测法 用于检 测SPCSV。检 测 法见附录D。6 脱毒种 薯（苗）的检 测程 序及质 量要 求 6.1 脱毒组 培苗 样品同 时利 用NCM-ELISA、PCR、RT-PCR 和指 示植 物4 种方法 进行 检测，4种 方法 的检测 结果 均应 为阴性，即 允许 带毒 率为0。6.2 原原种 先目测 调查 样品 的病 毒显 症率，然后 利用NCM-ELISA 或指示 植物 法进 行检 测，至少其 中10%的样品 分别利用PCR 和RT-PCR 检测。允许带 毒率 为0，允 许病 毒显症率 为0。6.3 原种 先目测 调查样 品的 病毒显 症率，然后利 用NCM-ELISA 或指示 植物进 行检 测，至 少其中5%的样 品分 别利用PCR 和RT-PCR检测。SPFMV、SPLV、SPVG、SPV2 和SPCFV的允许 带毒率 2.0%，SPCSV 和SPLCV的允许带毒率 为0。允 许病 毒显 症率1.0%。6.4 大田用 种 先目测 调查样 品的 病毒显 症率，然后利 用NCM-ELISA 或指示 植物进 行检 测，至 少其中1%的样 品分 别利用PCR 和RT-PCR 检测。SPFMV、SPLV、SPVG、SPV2 和SPCFV 的允 许带 毒率 10.0%，SPCSV和SPLCV的允许带毒率 为0，允 许病 毒显 症率5.0%。DB41/T 987 2014 4 A A 附 录 A（规范 性附 录）硝酸纤 维素 膜酶 联免 疫吸 附测定（NCM-ELISA）检 测法 A.1 溶液配 制 除非另 有规 定仅 使用 分析 试剂。水为 无菌 蒸馏 水。A.1.1 Tris-HCl 溶液c(Tris-HCl)=1.0 mol/L：称取60.60 g的三 羟甲 基氨 基甲 烷（Tris）溶于 300 mL 无菌 蒸馏 水中，加 入32.5 mL 浓盐 酸（HCl），调节pH值为7.5，定容 至500 mL。4 保 存备 用。A.1.2 氯化钠 溶液c(NaCl)=5.0 mol/L：称取292.20 g 氯化钠，在800 mL无菌蒸 馏水中，溶解 定容 至1 L。4 保存 备用。A.1.3 三羟甲 基氨 基甲 烷溶 液（TBS）：分别 取1 mol/L Tris-HCl（A.1.1）20 mL 和5 mol/L 氯化 钠（A.1.2）100 mL，混合 后用无菌 蒸馏 水定 容至1 L。A.1.4 洗涤缓 冲液（TBST）：0.5 mL 吐温-20（Tween-20）溶于1 L TBS（A.1.3）中。A.1.5 抽提缓 冲液：称取 亚硫酸 钠（Na2SO3）0.20 g 溶于TBS（A.1.3）中，定容 至100 mL。A.1.6 封闭缓 冲液：称 取脱 脂奶 粉 0.50 g，分 别量 取 曲拉通（Triton）X-100 0.5 mL和TBS（A.1.3）25 mL。先将脱脂奶粉溶于少 量TBS（A.1.3）中，再用TBS（A.1.3）定容至25 mL，加入Triton X-100混合均 匀，现配 现用。A.1.7 抗体缓 冲液：称 取脱 脂奶 粉 1.00 g，量 取TBS（A.1.3）50 mL。先 将脱 脂奶 粉溶解 于少 量TBS（A.1.3）中，再用TBS（A.1.3）定容 至50 mL。A.1.8 底物缓 冲液：分别 称 取三 羟甲基 氨基 甲烷6.10 g、氯化钠2.90 g、氯化 镁（MgCl2 6H2O）0.50 g，溶 于400 mL 蒸馏水中，用浓 盐酸 调pH 值至9.5，定 容至500 mL。A.1.9 氯化硝 基四 氮唑 蓝（NBT）储备液：称 取0.04 g NBT 溶于1.2 mL 70%N，N-二甲基甲 酰胺（DMF）中，-20 避光 保存 备用。A.1.10 5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐（BCIP）储备 液：称取0.02 g BCIP 溶于1.2 mL N，N-二甲 基甲 酰胺（DMF）中，-20 避 光 保存备 用。A.1.11 NBT/BCIP底 物溶液：先后 取100 L NBT 贮备 液（A.1.9）和100 L BCIP 贮备 液（A.1.10），加入25 mL 底物缓 冲液 中，振摇混 匀,现配现 用。A.2 样品制 备 将待测 叶片 用清 水清 洗干 净，从 每一 样品 上中 下部 的叶片 上各 取一 直径 约1 cm圆片。放 入研 钵中，加入3 mL抽 提缓 冲液 充分 研磨，6000 r/min离心2 min，取 上清 液点 膜。A.3 操作步 骤 A.3.1 点膜 将划好 方格（1 cm1 cm）的硝 化纤维 素膜 用TBS 缓 冲液处 理后放 在洁 净的滤 纸上，每个样 品各 吸取15 L 上清 液滴在 膜上 方 格的正 中，室 温干 燥15 min30 min。同时设 阳性、阴性和 空白对 照。根据需要设 置重 复。DB41/T 987 2014 5 A.3.2 封闭 将干燥 后的 膜浸 入封 闭缓 冲液中，室 温下 摇床 振荡1 h，转 速为50 r/min。A.3.3 与一抗 反应 将膜置 于用 抗体 缓冲 液稀 释至工 作浓 度的 病毒 特异 性抗体 溶液 中，室温 下摇 床振荡10 h 12 h，转速为50 r/min。A.3.4 洗膜 用洗涤 缓冲 液洗 膜4 次，每 次摇床 振荡3 min，转速 为80 r/min。A.3.5 与二抗 反应 用滤纸 将膜 表面 的溶 液吸 干，将 膜放 入用 抗体 缓冲 液 稀释至 工作 浓度 的碱 性磷 酸酶标 记的 抗体 溶 液中，室 温下 摇床 振荡1 h，转速为50 r/min。A.3.6 洗膜 洗涤4 次，方法 同A.3.4。A.3.7 显色 用滤纸 将膜 表面 的溶 液吸 干，将 膜置 于NBT/BCIP底物溶液 中，避光 缓慢 摇动。A.3.8 终止反 应 弃去底 物溶 液并 用蒸 馏水 洗膜3 次，每次 摇床 振荡10 min，转速 为50 r/min。A.3.9 结果判 断 晾干后 观察 颜色 反应，阳 性样品 在膜 上形 成紫 色沉 淀，阴 性样 品则 无颜 色反 应。DB41/T 987 2014 6 B B 附 录 B（规范 性附 录）指示植 物检 测法 B.1 繁育指 示植 物 在防虫 条件 下盆 栽巴 西牵 牛（Ipomoea setosa），至12 片真 叶时 嫁接。B.2 嫁接 以待测 样品 的茎 蔓为 接穗，巴西 牵牛 为砧 木，在巴 西牵牛 的茎 部（子叶 处）斜切，将待 检样 品 底 端削成楔 型，插入 砧木 的切 口内，用封 口膜 扎紧，置25 30 防 虫网 室内，嫁接15 d 30 d 后观 察记载症状。每 个样 品重 复至 少3次（3株），同时 设阳 性和阴 性对 照。B.3 结果判 断 根据巴 西牵 牛是 否表 现花 叶、叶 片扭 曲、明脉、黄 化以及 植株 矮化 等症 状，确定是 否带 毒。所 有 嫁接的巴 西牵牛 植株 均没有 表现任 何病毒 病症 状，样 品为阴 性；只 要有1 株表 现 病毒病 症状，该样 品判 断为阳性。DB41/T 987 2014 7 C C 附 录 C（规范 性附 录）聚合酶 链式 反应（PCR）检测法 该方法 用于 检测 甘薯 卷叶 病毒（SPLCV）。C.1 试剂及 缓冲 液配 制 先用按C.1.1C.1.6 配方配置 50 倍的浓 贮存 液，使用时再 用无 菌蒸 馏水 稀释 至工作 浓度。C.1.1 TAE电泳缓 冲液：称 取三 羟基甲基 氨基 甲烷（Tris）242.0 g、冰 乙酸57.1 mL、Na2 EDT A2H2O 37.2 g，用 氢氧 化钠 调pH 值至8.5，灭菌 双蒸 水定 容至1 L。C.1.2 溴化乙 锭（EB）溶液：称 取溴化 乙锭20.00 mg 溶于20 mL灭菌双 蒸水 中。C.1.3 1.0%琼 脂糖凝 胶板：称取1.00 g琼脂糖 加入100 mL TAE电泳 缓冲液 中，在微波 炉中加 热至琼 脂糖融化，温度降 至50 60 时，加溴化 乙锭 溶液（EB）5 L，摇匀，倒入电 泳槽中 均匀 铺板，凝固后取下 梳子 使用。C.1.4 CTAB缓冲液：称 取CTAB（十六烷 基三 甲基 溴化 铵）20.00 g、NaCl 81.80 g、EDTA 5.80 g 和 Tris 12.10 g，溶于1 L 蒸 馏水中，用HCl 调pH 值至8.0，高 温灭 菌后 加入PVP（聚乙烯 吡咯 烷酮K30）10.00 g。C.1.5 TE缓冲 液：称取EDTA 0.30 g和Tris 1.20 g，溶于1 L 蒸馏水 中，用HCl 调pH 值至8.0，高温 灭菌。C.1.6 加样 缓冲液：称取EDTA 0.88 g、溴酚蓝 0.05 g，量取 丙三醇36 mL，溶于100 mL 蒸馏 水中，用氢氧 化钠 调pH 值至7.0。C.2 DNA提取-CTAB法 预热（60）CTAB 缓冲 液(C.1.4)。取0.5 g 新鲜 植 物材料，于液 氮中 研磨成 粉，把 粉末倒 入盛 有预热的600 L CTAB 缓冲 液(C.1.4)的1.5 ml 的eppendorf 管中，再 加入20 L 巯基乙 醇，轻轻 混匀；60 保温1 h，其间 摇动 几次；加入等 体积 的苯 酚/氯仿/异 戊醇（25:24:1），轻 轻混匀，室 温下 4500 r/min离心10 min；将上清 液转 入另一 离心 管中，加 入2/3体积的 异丙 醇，小心 混匀 后-20 放 置30 min 以上，可见DNA 絮状 沉淀；10000 r/min 离心10 min，弃去 上 清液；沉淀加 清洗缓 冲液（70%乙醇，100 mmol/L醋酸铵）漂洗2 3次，10000 r/min离心10 min，沉 淀风干 后溶于50 L TE 缓冲液(C.1.5)。开 展后续试验或-20 保 存备 用。C.3 PCR C.3.1 引物 上游引 物BM-V：5-KSGGGTCGACGTCATCAATGACGTTRTAC-3，下游引 物BM-C：5-AARGAATTCATKGGGGCCCARARRGACTGGC-3。C.3.2 PCR扩增 PCR反应体 系为：灭 菌重 蒸水36.7 L，dNTPs（2.5 mmol/L）4 L，10Ex Taq Buffer(含MgCl2)DB41/T 987 2014 8 5 L，上游 引物BM-V（10 mol/L）和 下游 引物BM-C（10 mol/L）各1 L，Ex Taq DNA聚合酶(5 U/L)0.3 L，模 板DNA 2 L。PCR 反应 条件 为：94 3 min，接 着进 行35 个循 环，条件为94 1 min、55 1 min和72 3 min，最 后72 延 伸10 min。C.3.3 PCR产物的 电泳 检测 制备1.0%琼脂糖 凝胶 板（C.1.3）。在 电泳 槽中 加入TAE 电泳 缓冲 液(C.1.1)。每个样品 取10 L PCR产物与 加样 缓冲 液混 合后，加入 凝胶 孔进 行电 泳。恒压（120 V150 V）下 电泳20 min 30 min，经EB染色后，将凝胶 放到 凝胶 成像系 统上 观察 结果。C.3.4 试验成 立的 条件 PCR产 物经 电泳 检测，阳性 对照在 预期 大小（2800 bp）的位 置出 现特 异性 条带，同时，阴性 对照 和空白对 照均 没有 出现 预期 大小的 目的 条带。C.3.5 结果判 定 应用本 标准的 检测 方法对 待检样 品进行 检测，如果 在2800 bp对 应位 置出现 特 异性条 带，则 判定 样品为SPLCV 病毒 阳性，否 则 判定样 品为 该病 毒阴 性。DB41/T 987 2014 9 D D 附 录 D（规范 性附 录）反转录 聚合 酶链 式反 应（RT-PCR）检 测 法 该方法 用于 检测 甘薯 褪绿 矮化病 毒（SPCSV）。D.1 试剂及 缓冲 液配 制 D.1.1 DEPC水：取焦碳 酸二 乙酯（DEPC)50 L 加至100 mL灭菌蒸 溜水中，室温 放置10 h 12 h，121 高温 灭菌15 min，分装到DEPC（D.1.1）处理过的离 心管 中。D.1.2 引物溶 液：用DEPC水（D.1.1）将上、下游 引物 分 别配制成 浓度 为10 mol/L 的 溶液。D.1.3 TAE电泳 缓冲 液、1.0%琼脂 糖凝胶 板和溴 化乙 锭（EB）溶液：TAE 电泳缓 冲液、溴化乙 锭（EB）溶液和1.0%琼脂 糖凝 胶板 配制方 法分 别同 附录C.1.1、C.1.2 和C.1.3。D.2 RNA提取-Trizol 法 称取0.1 g叶 片放于 研钵 中，加液 氮充分 研磨 成粉，将粉末 迅速转 入到 无RNase 的无菌1.5 mL 离心管中，加入1 mL Trizol 迅速振荡 混匀；4 12000 r/min，离 心5 min；取上 清液，加入200 L氯仿，混匀，室温 放置15 min；4，12000 r/min，离心15 min；吸 取上 层水 相至 新 的无菌1.5 mL 离心 管中，加入0.5 mL异 丙醇，混匀，室温 放置10 min；4，12000 r/min，离心10 min，弃 上清液，留沉淀；加入1 mL 75%乙 醇，温和 振荡离 心管，悬 浮沉 淀；4，12000 r/min，离心5 min，弃上 清液，将 离心管倒置 于灭 菌滤 纸上，自 然干燥；加 入25-200 L DEPC水（D.1.1）溶解 沉淀，即得 到总RNA。D.3 RT-PCR D.3.1 引物 上游引 物CSV70P1：5-GACGGKGGTACKATGAARGTCC-3，下游引 物CSV70P2：5-GGCTCACAAACHGAYTTCATAAACAT-3。D.3.2 反转录 反转 录反应体 系为：dNTPs（10 mmol/L）1 L，MgCl2（25 mmol/L）1 L，5AMV缓冲 液 2 L，AMV（5 U/L）0.5 L，RNase抑制 剂（40 U/L）0.25 L，模板 核酸5 L，下游 引物CSV70P2（10 mol/L）0.5 L。反 转录 反应 条件 为：42 50 min，99 5 min。D.3.3 PCR扩增 PCR反应体 系为：灭 菌重 蒸水33.7 L，dNTPs（2.5 mmol/L）4L，10Ex Taq Buffer(含MgCl2)5 L，上 游引 物CSV70P1（10 mol/L）和下 游引 物CSV70P2（10 mol/L）各1 L，Ex Taq DNA聚合酶(5 U/L)0.3 L，cDNA 5 L。PCR 反应条 件为：94 3 min，接着 进行35个循环，条件 为94 30 s、55 30 s 和72 50 s，最后72 延 伸10 min。D.3.4 PCR产物的 电泳 检测 DB41/T 987 2014 10 制备1.0%琼脂糖凝 胶板（C.1.2）。在 电泳槽 中加 入1TAE 缓冲 液。每 个样品 取10 L PCR 产物 与加样缓 冲液 混合 后，加入 凝胶孔 进行 电泳。恒 压（120 V150 V）下电 泳20 min 30 min，经EB 染 色后，将凝胶 放到 凝胶 成像 系统 上观察 结果。D.3.5 试验成 立的 条件 PCR产物 经电 泳检测，阳 性 对照在 预期大 小（431 bp）的位 置出现 特异 性条带，同时，阴性 对照 和空白对 照均 没有 出现 预期 大小的 目的 条带。D.3.6 结果判 定 应用本 标准 的检 测方 法对 待检样 品进 行检 测，如果 在431 bp对应位 置出 现特 异性条 带，则判定 样品为SPCSV病毒阳 性，否则 判定样品 为该 病毒 阴性。_