油菜黑胫病菌鉴定方法DB34／T 2167-2014.pdf

ICS 65.020 B 30 DB34 安 徽 省 地 方 标 准 DB 34/T 21672014 油菜黑胫病菌鉴定方法 Detection and identification of Leptosphaeria biglobosa(Desm.)Ces.et De Not.文稿版次选择 2014-09-23 发布 2014-10-23 实施安徽省质量技术监督局 发 布 DB34/T 21672014 I 前 言 本标准依据 GB/T 1.12009 给出的规则起草。本标准由安徽省农业科学院作物研究所提出并起草。本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。本标准主要起草人：荣松柏、李强生、胡宝成、江莹芬、陈凤祥、吴新杰、费维新、侯树敏、范志雄、雷伟侠、郝仲萍。DB34/T 21672014 1 油菜黑胫病菌鉴定方法 1 范围 本标准规定了油菜黑胫病菌的现场和室内鉴定的依据和检测方法。本标准适用于油菜黑胫病菌的鉴定。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 鉴定依据 油菜黑胫病菌 Leptosphaeria biglobosa(Desm)Ces.&de Not.属真菌界(Fungi)，子囊菌门(Ascomycota)，座 囊 菌 纲(Dothideomycetes)，格 孢 腔 菌 目(Pleosporales)，格 孢 腔 菌 科(Pleosporaceae)，小球腔菌属(Leptosphaeria)；无性态属茎点霉属Phoma lingam。由Leptosphaeria biglobosa 病菌引起的油菜病害称为油菜黑胫病。鉴定依据：以油菜黑胫病为害症状、病菌形态学特征、PCR 反应和致病性测试结果为鉴定依据。4 主要仪器与用具 生物显微镜、体视显微镜、培养箱、植物生长箱、高速冷冻离心机、纯水仪、超净工作台、高压灭菌锅、液氮罐、制冰机、PCR 仪、凝胶成像系统、电泳仪、冰箱、旋涡振荡器、电子天平（感量 0.01 g）、烘箱、培养皿、酒精灯、解剖刀、接种针、移液器、离心管。5 主要试剂与材料 5.1 试剂 次氯酸钠，链霉素，氨苄青霉素，商用DNA提取试剂盒或 DNA 提取试剂：Tris base，EDTA，NaCl，SDS，-巯基乙醇，聚乙烯基吡咯烷酮（PVP），林菲罗琳；PCR 试剂：PCR buffer，Mgcl2，dNTP，Taq酶；凝胶电泳试剂：琼脂糖，TAE，Loading Buffer，EB。5.2 培养基 琼脂培养基（Agar），马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA-potato dextrose Agar），马铃薯葡萄糖肉汤（PDB-potato dextrose broth）液体培养基，V8 果汁琼脂培养基。见附录A。5.3 对照菌株 DB34/T 21672014 2 油菜黑胫病菌（Leptosphaeria biglobosa(Desm)Ces.&de Not.）菌株；油菜茎基溃疡病菌(Leptosphaeria maculans(Desm)Ces.&de Not.)提取的DNA（L.maculans 不是必需的）。6 现场检测 植株症状诊断在油菜生长期进行田间症状目测踏查。根据油菜黑胫病典型症状进行诊断。子叶/叶片症状：黑色坏死斑点（由致病力弱的菌株造成）；或灰白色病斑（由致病力强的菌株造成），病斑易破裂，有黑色小粒点（为分生孢子器）。（见附录 B，图 1、2、3）茎杆表面症状：早期染病茎秆部位呈灰色，病斑处有黑色的边界。后期茎秆干枯时，病斑呈灰白色，有时灰白色病斑处有小黑点（分生孢子器）生成。（见附录 B，图 4、5）茎秆横截面症状：感染组织横切面有黑色部分，为茎髓组织溃疡，面积因病菌侵染程度而不同，严重时染病植株茎基部受侵染形成腐烂。（见附录 B，图 6、7）对于田间不能确定的，采集疑似症状的植株样本进行室内检测鉴定。7 实验室检测 7.1 病菌的分离纯化 见附录C。7.2 菌落培养特性和病菌形态特征鉴定 病原菌(L.biglobosa)在PDA 平板上，菌丝呈黄色绒毛状，菌丝分枝少，菌落规则。培养一段时间后，气生菌丝上产生黄色（或黄棕色、红棕色）液珠，且菌株间存在色素水平差异。在衰老菌丝体上可观察到黑色小粒点（为分生孢子器），（见附录D，图1、2、3、4）；分生孢子器球形至扁球形，深黑褐色，散生、埋生或半埋生于菌丝中。分生孢子为无色透明，椭圆形至纺锤形，内含2 个油球，分生孢子大小 35.5 m 1.32.7 m（见附录D，图5）。子囊壳呈球形，黑色，有孔口，直径 360 m500 m；子囊棍棒形，内有 8 个子囊孢子，（见附录D，图6）；子囊孢子长椭圆形，具 58 个隔膜，黄褐色，大小（3070）m（49）m，（见附录D，图7）。7.3 PCR检测 7.3.1 病原菌基因组DNA的提取 见附录E。7.3.2 PCR检测鉴定 PCR 扩增出与 L.biglobosa 阳性对照分子量大小（440 bp）一致的单一明亮条带，判定为油菜黑胫病菌 L.biglobosa，（见附录F）。7.4 致病性测定 选取形态特征与 L.biglobosa 形态特征相符且 PCR 检测阳性的分离菌株，在 V8 果汁琼脂培养基上培养获得分生孢子，用无菌水配置成浓度为 107/mL 分生孢子悬浮液。选取健康感病油菜品种播种，播种 12 天后的子叶进行分生孢子接种。接种时将子叶用灭菌针轻轻刺伤，在伤口处接种 10 L 的分生孢子悬浮液。将接种过的幼苗保湿 48 小时（约 100相对湿度），期间如有新生真叶出现，DB34/T 21672014 3 将其剪去，以延缓子叶衰老的时间。在接种后 714 d 观察子叶发病情况。子叶侵染症状的主要特征表现为：子叶被浸染后，初现淡褐色斑，后呈灰白色，稍凹陷、易破裂，上生黑色小粒点（分生孢子器），感染严重时导致子叶枯死。对接种发病的子叶再做病原菌分离、培养，观察是否与 L.biglobosa 一致的形态特征，并对分离菌进行 PCR 检测。8 结果判定 符合L.biglobosa 为害症状，菌落培养特性和病菌形态学特征与 L.biglobosa 相符，PCR 扩增出与 L.biglobosa 阳性对照分子量大小（440 bp）一致的单一明亮条带，且致病性测试为阳性的分离物，判定为油菜黑胫病菌 L.biglobosa。9 材料保存与处理 9.1 样品保存与处理 样品经登记和经手人签字后妥善保存。感染的黑胫病植株样品放在阴凉干燥处保存；对检出油菜黑胫病菌的样品应保存于 4冰箱中，以备复核。样品保存期满后须经高压灭菌或其它有效灭活方法处理。9.2 菌株保存与处理 分离鉴定的菌株应妥善保存，菌株在 PDA 平板培养后可于 4冰箱保存，每 90 d 定期继代，或将带有菌丝的培养基块转入 30%灭菌甘油中于-80保存。对不需长期保存的菌株应及时灭活处理。9.3 结果记录与资料保存 完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，测试的时间、地点、方法和结果等，并有实验人员和审核人员签字。DB34/T 21672014 4 A A 附 录 A（资料性附录）培养基 A.1 琼脂培养基（Agar）琼脂 1520 g，加纯水 1000 mL，调至 pH 5.8，121高压灭菌 20 min，备用。A.2 马铃薯葡萄糖琼脂培养基（potato dextrose Agar，PDA）将马铃薯去皮 200 g，切成小块，加水 1000 mL 煮沸 30 min，双层纱布过滤，滤液加 20.0 g 葡萄糖和 20.0 g 琼脂，并加水补足至 1000 mL，121高压灭菌 20 min，备用。商品 PDA 粉，其常规用量为 1000 mL 纯水中加 39 g PDA 粉，121高压灭菌 20 min，备用。A.3 马铃薯葡萄糖肉（potato dextrose broth，PDB）液体培养基 商品 PDB 粉 24 g，加纯水配制成 1 L 的培养液。A.4 V8果汁琼脂培养基 V8 果汁 200 mL，CaCO3 2 g，琼脂 1520 g，pH 5.8，0.05 g-谷甾醇，加纯水补足至 1000 mL，121高压灭菌 20 min，备用。DB34/T 21672014 5 B B 附 录 B（资料性附录）油菜黑胫病菌为害植株典型症状 图B.1 子叶上灰白色病斑，上生黑色小粒点（分生孢子器）图B.2 叶片上黑色的坏死斑 图B.3 叶片上灰白色病斑，上生黑色小粒点（分生孢子器）图B.4 早期茎秆部位病斑呈灰色，有黑色的边界 图B.5 茎秆干枯时病斑呈灰白色，灰白色病斑中可见小黑点（分生孢子器）图B.6 病斑部位横切面可见组织患病呈黑色 图B.7 染病植株茎基部腐烂 DB34/T 21672014 6 C C 附 录 C（资料性附录）病菌的分离纯化 C.1 油菜植株 将采集疑似症状的植株样本用自来水洗净，晾干组织表面的水；从油菜植株的病斑处切取大小约 0.2 0.2 cm 的植物组织，70酒精浸泡 1 min，无菌水清洗 2 次，再放入 10的次氯酸钠溶液中表面消毒约 2 min，无菌水清洗 23 次，用无菌滤纸吸干表面多余水分。C.2 油菜种子或油菜籽 将异常(变色、畸形、皱缩等)种子挑取出来，用 70酒精浸泡 1 min，无菌水清洗 2 次，再放入10的次氯酸钠溶液中表面消毒约 2 min，无菌水清洗 23 次，用无菌滤纸吸干表面多余水分。C.3 病菌的分离纯化 将表面消毒后的油菜种子（或油菜籽）或植物组织样品置琼脂培养基上，20黑暗条件下培养 35 d，样品边缘有真菌菌丝生成。无菌条件下挑取少量菌丝体，转移至添加抗生素的 PDA 培养基（添加 100 mg/L 链霉素和 50 mg/L 氨苄青霉素）上，20培养 57 d，挑取菌丝体边缘少量菌丝转移至不含抗生素的 PDA 培养基上，培养 36 d，再次挑取边缘菌丝接种至 PDA 培养基，直至纯化。DB34/T 21672014 7 D D 附 录 D（资料性附录）油菜黑胫病菌菌落培养性状和病菌形态特征 图D.1 菌落的不同形态与特征 图D.2 菌落的不同形态与特征 图D.3 菌落的不同形态与特征 图D.4 菌落的不同形态与特征 图D.5 分生孢子 图D.6 假囊壳 图D.7 子囊孢子 DB34/T 21672014 8 E E 附 录 E（资料性附录）PCR所用试剂配制及 DNA 提取 E.1 DNA 提取缓冲液 配制 500 mL 的 TEN（2）母液：6.06 g Tris Base，0.37 g EDTA，8.77 g NaCl，加 dH2O 至 500 mL，以 HCl 调 pH 至 7.2；10SDS（10十二烷基硫酸钠溶液）；以 1:1:0.1 的比例混合TEN（2）、10SDS、1（终浓度）、-巯基乙醇；在上述混合液中加入 2(终浓度)的聚乙烯基吡咯烷酮 PVP 和 5 mM（终浓度）的邻菲罗琳；7.5 M 醋酸铵：称取 57.8 g 醋酸铵，以 dH2O 溶解并定容至 100 mL。E.2 TE 缓冲液 10 mM Tris(pH 7.5)加 0.1 mM EDTA。2 CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)提取缓冲液：10 mM Tris-HCl、1.4 M NaCl、20 mM EDTA、1-巯基乙醇。E.3 SDS 法油菜染病组织中直接提取真菌DNA 1)将小片（约 2 mm2 mm）植物病斑组织置 1.5 ml 离心管中，预先冷冻（-20）数小时后，进行低温冷冻干燥处理（24 h）；2)使用与离心管匹配的金属（或塑料棒）将干燥后的样品充分碾碎；3)加入 0.6 mL DNA 提取缓冲液；4)充分振荡之后置 70水浴中静置 30 min；5)加入 0.3 ml 冷冻的 7.5 M 醋酸铵；6)充分振荡后置冰中 30 min；7)15000 g 高速离心 10 min，吸取上清液至在 1.5 mL 离心管中；8)加入上清等体积预先预冷的（-20）异丙醇，-20 下静置 1h；9)15000 g 高速离心 10 min；10)倾去异丙醇，加入 0.8 mL 预先冷冻的 70乙醇洗涤沉淀物；11)15000 g 高速离心 5 min 收集 DNA 沉淀；12)倾去乙醇，自然干燥；13)沉淀用 TE 溶解，-20 保存备用。E.4 CTAB 法从纯化的菌丝体中提取 DNA 将通过形态鉴定初步筛选的疑似 L.biglobosa 菌株接种至 PDB（potato dextrose broth）液体培养基中，水平振荡培养（23，180 rpm）10 d，14000 g 离心 5 min 收集菌丝，提取菌丝体 DNA。(1)将菌丝进行低温冷冻干燥处理（24 h），保存在-20待用；(2)取 0.10.2 g 菌丝于1.52 mL 的离心管中，用玻璃棒将干燥后的菌丝充分碾碎；DB34/T 21672014 9(3)加入 0.61 mL CTAB 提取缓冲液，充分振荡之后置 70水浴中静置 30 min；(4)15000 g 高速离心 10 min，吸取上清液至在 1.5 mL 离心管中；(5)在上清液中加入等体积的氯仿:异戊醇（24:1），振荡混合 30 sec，14000 g 离心 10 min。(6)收集上清液，加入 0.1 倍体积的 3 M 醋酸钠和 2 倍体积的冰冻 100乙醇，小心混匀；(7)混合液置-20低温下 1 h 以沉淀 DNA；(8)15000 g 离心 10 min 收集沉淀物；(9)用预先冷冻的 70乙醇洗涤 DNA 两次；(10)DNA 干燥后，溶于 200 L 的 1 m M TE 缓冲液中（DNA 终浓度约为 50100 ng/L），-20保存备用。DB34/T 21672014 10 F F 附 录 F（规范性附录）PCR 检测程序 根据黑胫病菌 L.biglobosa 基因组中 ITS 序列信息，设计了黑胫病菌特异性 PCR 扩增引物：LmacB（L.biglobosa forward primer）:5-ATCAGGGGATTGGTGTCAGCAGTTGA-3;反向引物 LmacR（Reverse primer）:5-GCAAAATGTGCTGCGCTCCAGG-3。同时加入茎基溃疡病菌 L.maculans 的引物对照 LmacA（L.maculans forward prime r:5-CTTGCCCACCAATTGGATCCCCTA-3;），它们拥有共同的反向引物 LmacR。多重 PCR 反应体系：样品 DNA 4 L，LmacA(100 ng/l)：1 L，LmacB(100 ng/L)：1 L，LmacR(100 ng/L)：2 L，Taq DNA 聚合酶（5/L）：0.2 l，dNTP(10 mM)：0.4 L，MgCl2(25 mM)：1.2 L，10 Buffer：2.0 L，ddH2O：8.2 L，反应总体系共 20 L。PCR 反应程序：95 2 min；95 30 sec，63 30 sec，72 1 min，40 个循环；72 10 min。电泳 取 5 L 扩增产物与 1 L 的样品缓冲液(loading buffer)混匀，在 1琼脂糖凝胶（含 0.1EB）中电泳（电泳缓冲液 1 TAE，电压 120 V，时间 1 h），在凝胶成像系统中观察，记录观察结果，对样品 PCR 扩增条带拍照并保存。结果判定 黑胫病菌 L.biglobosa DNA 扩增产物大小 440 bp，与阳性对照（22 号样品）分子量大小相同；茎基溃疡病菌 L.maculans DNA 扩增产物大小 334 bp。图F.1 样品 PCR 检测电泳图 注：M 为 DL2000 DNA ladder maker，泳道 1-21 为待检样品，22 为 L.biglobosa 对照，分子量大小为 440 bp，23 为 L.maculans 对照，分子量大小为 334 bp。_