Ⅰ群血清4型禽腺病毒核酸PCR检测技术规程DB34／T 3121-2018.pdf

ICS 11.220 B 41 DB34 安徽省地方标准 DB 34/T 31212018 群血清 4型禽腺病毒核酸 PCR检测 技术规程 Technical Regulations of PCR Assay for Detection of Fowl Aviadenovirus Serotype 4 Nucleic Acid 文稿版次选择 2018-04-16发布 2018-05-16实施安徽省质量技术监督局发布 DB34/T 31212018 I 前言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。本标准由阜阳市畜牧兽医局提出。本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：阜阳市立华畜禽有限公司、阜阳市动物疫病预防与控制中心、阜阳市畜牧兽医局、颍东区畜牧兽医局、阜阳市动物卫生监督所。本标准主要起草人：孟宪臣、张海涛、郭强、李东风、桑晓媛、高树朋、高永士、潘五岳、郑玉才、罗燕、刘新、薛亚梅、吴含萍、张娟娟。DB34/T 31212018 1 群血清4 型禽腺病毒核酸PCR 检测技术规程 1 范围 本标准规定了群血清 4 型禽腺病毒核酸 PCR 检测技术。本标准适用于对活禽肛拭子和病死禽肝脏进行群血清 4 型禽腺病毒的检测。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 21674 猪圆环病毒聚合酶链反应试验方法 3 缩略语 以下缩略语适用于本文件。FadV（Fowl Aviadenovirus）：群禽腺病毒。FAdV-4（Fowl Adenovirus-4）：群血清 4 型禽腺病毒。PCR（Polymerase Chain Reaction）：聚合酶链式反应。DNA（Deoxyribonucleic Acid）：脱氧核糖核酸。ExTaq 酶：从水生栖热菌 Thermus Aquaticus（Taq）中分离出的具有热稳定性的 DNA 聚合酶，ExTaq酶是其中的一种。PBS（Phosphate Buffer Solution）：磷酸盐缓冲液。SPF（Specific Pathogen Free）：无特定病原。4 主要仪器 4.1 高速台式冷冻离心机 4.2 生物安全 II级通风柜 4.3 PCR 扩增仪 4.4 核酸电泳仪 4.5 微量移液器（2 L、10 L、100 L、1000 L）4.6 超低温冰箱 4.7 核酸凝胶成像系统 4.8 高压蒸汽灭菌锅 4.9 电热恒温鼓风干燥箱 4.10 微量振荡器 DB34/T 31212018 2 5 主要试剂 5.1 消化液(见第A.1 章)5.2 2蛋白酶K溶液（见第 A.2 章）5.3 酚-三氯甲烷-异戊醇混合液（见第 A.3 章）5.4 75乙醇（见第 A.4 章）5.5 Gold View 核酸染料 5.6 上游引物 P1：FAdV-4（10 M）5.7 下游引物 P2：FAdV-4（10 M）5.8 琼脂糖（分析纯）5.9 50TAE 缓冲液（见第 A.5 章）5.10 PBS（见第 A.6 章）5.11 DL2000 DNA Marker（见第A.7 章）5.12 10Loading Buffer（见第A.7 章）5.13 双蒸水（符合 GB/T 6682 要求）5.14 PCR 用ExTaq（见第A.8章）5.15 10ExTaq buffer(Mg2+plus)（见第A.8 章）5.16 dNTP Mixture（见第A.8章）6 引物 根据 GenBank 登录的 FAdV-4(GenBank:GU188428.1)Hexon 基因核苷酸序列，设计用于扩增FAdV-4 的 PCR 引物，FAdV-4 上游引物 P1：FAdV-4（5-GACCGTTACAAGTTTAGCATCTCC-3），FAdV-4下游引物 P2：FAdV-4（5-TCGCAGGAAGTCGTAGTGGA-3），扩增核酸片段大小为 951 bp。如果制备的核酸模板中有 FAdV-4，PCR 产物电泳后在 951 bp 处出现条带，即为阳性，反之即为阴性。7 样品的采集和处理 7.1 采样工具 7.1.1 棉拭子和 1.5 mL 离心管，经 121高压灭菌 15 min，烘干。7.1.2 剪刀、镊子和研磨器，经 160干热灭菌 2 h。7.2 样品采集 7.2.1 活禽 取泄殖腔拭子，采集方法如下：取泄殖腔拭子时，将拭子深入泄殖腔转一圈并沾取少量粪便；将拭子一并放入盛有 1.0 mL 含双抗 PBS（高压冷却后的 PBS，无菌条件下加入青霉素、链霉素各 10000 IU/mL）的1.5 mL 离心管中，加盖标记。7.2.2 病死禽 病死禽剖检并取肝脏装入一次性塑封袋或其他灭菌容器，标记，送实验室。DB34/T 31212018 3 7.3 样品储运 样品采集后，放入密闭的塑封袋内（一个采样点的样品，放在一个塑封袋内），于保温箱中加冰、密封，24 小时内进行样品处理。7.4 样品处理 7.4.1 泄殖腔拭子 样品在震荡器上充分混合后，取上清液转入无菌的 1.5 mL 离心管，编号备用。7.4.2 组织脏器 取待检样品约 2.0 g 于洁净、干热灭菌的研磨器中充分研磨，加 5 mL PBS 混匀，反复冻融 3 次后，取上清液转入无菌的 1.5 mL 离心管，编号备用。7.5 处理后的样品存放 制备的样品在 2-8条件下保存应不超过 24 h，如需长期保存应置-70以下，并应避免反复冻融。8 检测步骤 8.1 实验室规范 群血清 4 型禽腺病毒核酸 PCR 检测的实验室规范应符合 GB 19489 的要求。8.2 核酸提取 8.2.1 核酸提取参考 GB/T 21674 的要求。8.2.2 取n个灭菌的1.5 mL 离心管，其中 n 为被检样品、阳性对照和阴性对照数量之和，编号。其中阳性对照样品为血清学鉴定为 FAdV-4 的病料或阳性病料接种 SPF 鸡胚收获的尿囊液，阴性对照样品为灭菌双蒸水。8.2.3 每管加入待检样品（已研磨好的被检样品上清，阳性对照样品和阴性对照样品）100 L，加入500 L消化液和10 L 2蛋白酶 K溶液，混匀，置 55水浴中 4 h16 h。8.2.4 每管加入 600 L 酚-三氯甲烷-异戊醇混合液，用力颠倒 10 次混匀，13000 g 离心 10 min。8.2.5 取上清500 L 置1.5 mL灭菌离心管中，加入等体积异丙醇，混匀，置-70冰箱中30 min，取出离心管，室温融化，4，20000 g 离心15 min。8.2.6 弃上清，沿离心管开口方向管壁缓缓滴入 1 mL-20预冷的75乙醇溶液，轻轻旋转洗一次后倒掉，将离心管倒扣于吸水纸上 1 min，置 37干燥箱干燥 30 min。8.2.7 取出离心管，用 50 L灭菌双蒸水溶解沉淀，作为模板备用。若需长期保存须放置在-70冰箱。8.3 检测 8.3.1 扩增试剂准备 从 ExTaq 试剂盒中取出相应的 10ExTaq buffer(Mg2+plus)、ExTaq 酶和 dNTP Mixture，同时取出 FAdV-4 PCR 扩增引物和双蒸水。DB34/T 31212018 4 设所需 PCR 的检测总数为 n，其中 n 为被检样品、阳性对照与阴性对照之和，每个样本测试反应体系配制见表1。表1 每个样本测试反应体系配置表 试剂 用量/L 10ExTaq buffer(Mg2+plus)2 dNTP Mixture 1 P1：FAdV-4（10 M）0.5 P2：FAdV-4（10 M）0.5 ExTaq 酶 0.3 DNA 模板（质量浓度大于 129.6 pg/L）2 灭菌双蒸水 补至 20 8.3.2 加样 在各设定的 PCR 管中分别加入 8.2.6 中制备的 DNA 溶液各 2 L，瞬时离心数秒。8.3.3 PCR反应 将 8.3.2 中离心后的 PCR 管放入 PCR 扩增反应仪内，并对 PCR 管编号，记录对应样本。反应条件设置：第一阶段，94预变性 5 min；第二阶段，94变性 30 s，53退火30 s，72延伸 50 s，30个循环；第三阶段，72延伸 10 min。8.3.4 PCR 产物电泳检测 琼脂糖凝胶的配制：按 1比例称取琼脂糖加入适量 1TAE 电泳缓冲液中，用微波炉加热完全溶解后，按 1:10000的比例加入 Gold View 核酸染料，摇匀后倒入试剂中，待冷却使用。每个样本的 PCR 管取 9 L 的 PCR 产物，加入 1 L 的 10Loading buffer，混匀后，吸取 10 L 样品加入配制好的琼脂糖凝胶中，同时加入 DL2000 DNA Marker，之后在电压 100 V 下，经 1530 min 电泳，将凝胶放入凝胶成像系统中进行观察，并拍照记录。9 结果判定 9.1 实验成立条件 9.1.1 阴性对照样品在 951 bp位置处无条带。9.1.2 阳性对照样品在 951 bp位置处有清晰条带。9.2 结果描述及判定 9.2.1 阴性 样本对应的泳道在 951 bp 位置处无条带，表示样品中无群血清 4 型禽腺病毒核酸。DB34/T 31212018 5 9.2.2 阳性 样本对应的泳道在 951 bp 位置处出现明显的条带，表示样品中存在群血清 4 型禽腺病毒核酸(见附录第A.9 章)DB34/T 31212018 6 A A 附 录 A（规范性附录）实验用溶液配制 本标准所用试剂均为分析纯 A.1 消化液 A.1.1 1 mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸（Tris-HCL）（pH 8.0）三羟甲基氨基甲烷 12.11 g 灭菌双蒸水 80 mL 浓盐酸 调 pH 至 8.0 灭菌双蒸水 加至 100 mL A.1.2 0.5 mol/L 乙二铵四乙酸二钠（EDTA）溶液（pH 8.0）二水乙二铵四乙酸二钠 18.61 g 灭菌双蒸水 80 mL 氢氧化钠 调 pH 至 8.0 灭菌双蒸水 加至 100 mL A.1.3 20十二烷基硫酸钠（SDS）溶液（pH 7.2）十二烷基硫酸钠 20 g 灭菌双蒸水 80 mL 浓盐酸 调 pH 至 7.2 灭菌双蒸水 加至 100 mL A.1.4 消化液 1 mol/L 三羟甲基氨基甲烷-盐酸（Tris-HCL）（pH 8.0）2 mL 0.5 mol/L 乙二铵四乙酸二钠（EDTA）溶液（pH 8.0）0.4 mL 20十二烷基硫酸钠（SDS）溶液（pH7.2）5 mL 5 mol/L 氯化钠 4 mL 灭菌双蒸水 加至 200 mL A.2 2蛋白酶K溶液 蛋白酶 K（分析纯）5 g 灭菌双蒸水 加至 250 mL A.3 酚-三氯甲烷-异戊醇混合液 DB34/T 31212018 7 碱性酚 25 mL 三氯甲烷 24 mL 异戊醇 1 mL A.4 75乙醇 无水乙醇（100）（分析纯）750 mL 灭菌双蒸水 250 mL A.5 50TAE（三羟甲基氨基甲烷-乙酸）电泳缓冲液 羟基甲基氨基甲烷（Tris）（分析纯）242 g 冰乙酸 57.1 mL 0.5 mol/L 乙二铵四乙酸二钠溶液（pH 8.0）100 mL 灭菌双蒸水 加至 1000 mL 用时用灭菌双蒸水稀释使用。A.6 PBS(磷酸盐缓冲液)A.6.1 A 液 0.2 mol/L 磷酸二氢钠水溶液：磷酸二氢钠（NaH2PO4*H 2O）27.6 g，溶于蒸馏水中，最后稀释至1000 mL。A.6.2 B 液 0.2 mol/L 磷酸氢二钠水溶液：磷酸氢二钠（Na2HPO4*7H2O）53.6 g，加蒸馏水溶解，最后稀释至1000 mL。A.6.3 0.01 mol/L、pH 7.2 磷酸盐缓冲液的配制 0.2 mol/L A 液 14 mL，0.2 mol/L B 液 36 mL，加氯化钠（NaCl）8.5 g，用蒸馏水稀释至 1000 mL，121高压灭菌 15 min。A.7 DL2000 DNA Marker试剂盒 DL2000 DNA Marker 500 L 10Loading Buffer 1 mL A.8 ExTaq 试剂盒 ExTaq（5 U/L）50 L 10ExTaq buffer(20 mM Mg2+plus)1 mL dNTP Mixture（各 2.5 mM）800 L DB34/T 31212018 8 A.9 FAdV-4 PCR电泳图 见图A.1。图中：M：DL2000 Marker；1：阳性对照样品；2：阴性对照样品；3-5：检测样品。图A.1 FAdV-4 PCR电泳图 _