I群禽腺病毒感染诊断技术 第1部分：病毒分离鉴定DB37／T 3128.1-2018.pdf

ICS 65.020.30 B41 DB37 山东省地方标准 DB 37/T 3128.12018 I 群禽腺病毒感染 诊断技术 第1 部分：病毒分离鉴 定 Diagnostic techniques for Fowl Adenovirus Group I infection Part 1：Isolation and identification of FAdV group I 2018-02-02 发布 2018-03-02 实施 山东省质量技术监督局 发布 DB37/T 3128.12018 前 言 本标准 按照GB/T 1.1-2009 给出的 规则 起草。本标准 由山 东省 畜牧 兽医 局提出。本标准 由山 东省 畜牧 业标 准化技 术委 员会 归口。本标准 主要 起草 单位：山 东农业 大学。本标准 主要 起草 人：刁有 祥、陈 浩、唐熠、窦 砚国、郑肖 强。I DB37/T 3128.12018 I 群 禽腺病 毒感染 诊断技 术 第 1 部 分：病 毒分离鉴 定 1 范围 本标准 规定 了I 群禽 腺病 毒 样品的 采集 与保 存、病毒 的分离 和鉴 定等 的技 术要 求。本标准 中I 群 禽腺 病毒 分离与 鉴 定技 术适 用于I 群禽 腺 病毒中12种 血清 型病 毒的 分离鉴 定、间接 免疫荧光试 验（IFA）适 用于 上 述病毒 的检 测、限制 性片 段长度 多态 性分 析（RFLP）适用 于对I群禽 腺病 毒12种血清 型病 毒的 鉴定。2 规范性 引用 文件 下列文 件对 于本 文件 的应 用是必 不可 少的。凡 是注 日期的 引用 文件，仅 所注 日期的 版本 适用 于本 文件。凡 是不 注日 期的 引用 文件，其最 新版 本（包括 所有的 修改 单）适用 于本 文件。GB/T 6682 分析 实验 室用水 规 格和 试验 方法 GB 19489 实验 室生 物安 全通用 要求 GB/T 27401 实验 室质 量控 制 规范 动物 检疫 3 术语和 定义 下列定 义和 术语 适用 于本 文件。3.1 I群 禽腺 病毒 Fowl adenovirus group I 是引起 家禽包 涵体 肝炎和 肝炎-心 包积 液综合 征的病 原，基 于交叉 中和 试验结 果，该 病毒可 分为12种血清 型。3.2 间接免 疫荧 光试 验 Indirect immunofluorescence assay（IFA）用对应 某一 种抗 原的 抗体(这里被 称为 一抗)与细 胞孵育 结 合，在采 用对 应一 抗(也就是 抗一 抗)的抗体(这 里被 称为 二抗，二抗 上偶联 有荧 光素 分子)与 细 胞孵育 结合 后在 荧光 显微 镜下观 察，出现 绿色 荧光信号为 阳性 反应。3.3 限制性 片段 长度 多态 性分 析 Restriction Fragment Length Polymorphism（RFLP）利用限 制性 内切 酶能 识别DNA 分子 的特 异序 列，并在 特定序 列处 切开DNA 分子，即产生 限制 性片 段的特性，用于 检测DNA 序列 多 态性。3.4 LMH细胞 1 DB37/T 3128.12018 鸡胚肝 癌上 皮细 胞系，来 源于雄 性鸡 肝脏 肿瘤。4 实验室 质量 控制 4.1 实 验 室符合 GB19489 和 GB/T 27401 要求，实验 室必须 为 生物 安全 级（BSL-2 级）及以 上实 验室。4.1.1 操作中 注意 事项 4.1.1.1 从事PCR 工 作的 实验 室尽 可能分 区，根据 条件 划分 出前处 理区、核 酸提 取区、核酸 扩增 区、电泳检 测区，尽 可能 形成 有效的 物理 隔离，且 为单 一流向，不 得倒 流。4.1.1.2 特别注 意电 泳后 的琼 脂凝 胶要及 时处 理，避免 对实 验室造 成污 染。4.1.1.3 病毒分 离区 域的 鸡胚 接种 操作区 和细 胞培 养操 作区 也应遵 循一 定的 布局 原则，避免交 叉污 染。4.1.2 注意个 人防 护和 环境 保护，电泳 中用 到 的EB 可 诱发基 因 突变，试 验中被 EB 污 染的物 品要 有专用收集 处，并通 过适 当的 方式（如焚 烧、或送 有资 质的医 用垃 圾处 理公 司）进行无 害化 处理。4.1.3 生物样 品应 严格 控制 对环 境的污 染，试验 结束 后应 将相关 样品 收集 高压 灭菌 后，送 有资 质的 医用垃圾 处理 公司 做最 终处 理。4.2 人员 操作人 员应 接受 实验 室生 物安全、实 验室 质量 管理、细胞 培养 和分 子生 物学 实验室 检测 技术 培训。熟悉生 物样 品处 理、细胞 培养、以及 核酸 提取、基 因扩增 等分 子生 物学 技术。4.3 仪器设 备 a)生物安 全柜；b)PCR 仪；c)CO2 恒温 培养 箱（37 恒温）；d)台式低 温高 速离 心机（最 大转 速 12000r/min）；e)电泳仪；f)电泳槽；g)紫外凝 胶成 像仪；h)2C8C 冰箱；i)-20C 冰柜；j)微量移 液器（最 大量 程分 别为10 L、20 L、100 L、1000 L），带 滤芯的 枪 头；k)孵化器（37 恒温）；l)水平摇 床；m)电子天 平精 度为：0.001g；n)电磁炉 或微 波炉；o)荧光倒 置显 微镜（FITC）。4.4 试剂和 材料 除另有 规定 外，所有 生化 试剂均 为分 析纯。a)磷酸盐 缓冲 液（pH=7.07.4），见 A.1；b)细 胞 培养 液（含 10%血 清的 DMEM 培养 基）；c)细 胞 维持 液（含 1%血 清的DMEM 培 养基）；d)甲醇：丙酮（1:1）固 定液；e)抗 体 稀释液 PBST，见 A.2；2 DB37/T 3128.12018 f)商品化 的 FITC 标 记鼠 抗兔荧 光抗 体；g)兔抗I 群禽 腺病 毒多 克隆 抗体（灭活 疫苗 免疫 兔制 备）；h)50%甘油；i)商品化 的 DNA 提取 试剂 盒；j)rTaq DNA 聚 合酶(5 U/L)；k)10PCR Buffer；l)dNTPs（2.5 mmol/L）；m)商品化 的 DNA 分子 量标 准，要 求在 100 bp 2000 bp 之间，有5 条以 上的 指示 条 带；n)1.5%琼 脂糖 凝胶，见 B.1；o)1TAE 缓冲 液，见 B.2；p)溴化乙 锭（10g/L），见 B.3；q)核 酸 电泳 加样 缓冲 液，见B.4；r)商品化 核酸 凝胶 纯化 试剂 盒；s)DNA 限制 性内 切酶 Hae II；t)阳性对 照标准 品，I 群禽 腺病毒 细胞 培养 物；u)阴性对 照标 准品，高 压灭 菌的蒸 馏水；v)本 标 准中 使用 的水 均按照GB/T6682 制备 和使 用；w)SPF 鸡胚；x)LMH 细胞；y)Hexon 基 因扩 增引 物。FAV-AF：5-TGGACATGGGGGCGACCTA-3；FAV-AR：5-AAGGGATTGACGTTGTCCA-3，扩 增片段A 长度 约为1210 bp；FAV-BF：5-AACGTCAATCCCTTCAACCACC-3；FAV-BR：5-TTGCCTGTGGCGAAAGGCG-3，扩 增片段B 长度 约为1350 bp。上述引 物浓 度均 为 50 mol/L。5 样品采 集与 处理 5.1 样品采 集 采集疑 似 群禽 腺病 毒感 染死亡 家禽 肝脏、脾脏 和 肾脏等 组织 样品，进行 分 别处理 或同 时处 理；活禽采集 泄殖 腔拭 子。样品 置于密 闭容 器中 冷藏 运输，储藏 温度 不超 过4，时间 不 超过24h。5.2 样品保 存 5.2.1 室温条 件下 样品 在 1 h2 h 内 处理 完毕，未 能及 时处理 的 样本在 4 冰箱 中存放，不超 过 24 h；也可于-20 低 温条 件下 保存，不超 过30 d；-70 贮 存最 佳，不超过 1 年。5.2.2 组织研 磨液 和泄 殖腔 拭子 悬液置 于-20 低 温条 件下 保 存，不超 过2 周；-70 贮 存 不超过 30 d。5.3 样品处 理 5.3.1 在 生 物安 全柜 中，取 10 g 20 g 样品 放入 灭菌 的研钵 中，无 菌条 件下 磨碎。5.3.2 用含有 抗生 素（青 霉素(2000 IU/mL)、链霉素(2 mg/mL)、庆 大 霉 素（50g/mL）和制霉 菌素(1000 IU/mL)等 渗磷 酸盐 缓冲 液（PBS，pH 值7.0 7.4，附 录 A.1）配 成10%20%(g/mL)的悬 液；泄殖 腔拭子悬 液中 抗生 素浓 度提 高5 倍。加入 抗生 素后 pH 调至 7.0 7.4。3 DB37/T 3128.12018 5.3.3 5.3.3 样本 组织 悬液 反复 冻融 3 次，经 8000 r/min 离心 10 min，取 上清 并置4 过夜，次 日接种SPF 鸡 胚或 LMH 细胞 系。6 病毒分 离 6.1 鸡胚接 种 6.1.1 将处理 后的 样品 上清，每 份尿囊 腔接 种（3 枚5 枚）9 日龄 11 日龄 SPF 鸡胚，0.2 mL/胚，置于孵 化器 中，37 孵化 120 h。6.1.2 弃去 24 h 内死 亡胚，24 h120 h 内 死亡 和存 活鸡胚 置 4 冰 箱过 夜或-20 冷冻 1 h，分 别无菌收 集尿 囊液 并进 行无 菌检查，无 菌尿 囊液 盲传 三代。6.2 细胞接 种 6.2.1 将处理 后的 样品 上清 接种 单层LMH 细胞，孵育 1 h，吸 弃上 清，用 PBS 缓 冲液 轻 轻洗涤 2 次，吸弃后 加入 细胞 维持 液。6.2.2 70%以 上单 层细 胞出 现细 胞病变 时，将细 胞培 养物 冻融后，转 移至 冻存 管置 于-70 保存，不超过3 年。7 病毒鉴 定 7.1 间接免 疫荧 光法（IFA）7.1.1 细胞固 定 将接种 病毒48 h 的LMH 细胞培 养 板用PBS 缓冲 液轻 轻洗涤3次4次，吸 弃液 体。每孔加 入用-20 预冷的甲 醇：丙酮（1:1）固 定 液150 L，置 于-20 孵 育10 min，吸弃 固定 液。干 燥 后用PBS 缓冲 液洗 涤3次。7.1.2 一抗孵 育 用抗体稀释液（PBST，见 附录A.2）将 兔抗I 群禽 腺 病毒多克隆抗 体作1:200 倍 稀释，每孔加 入100L，置 于湿 盒中，37 孵 育1 h。吸 弃后 用PBS 洗涤3次。7.1.3 二抗孵 育 避光条 件下，用PBST 将FITC 标记 鼠抗 兔抗 体作1:200 倍 稀 释，每孔 加入100 L，置于 湿盒 中，37 孵育1 h。吸 弃后 用PBS 洗涤3 次。7.1.4 封片观 察 加入数 滴50%甘油（附录A.3）封 片，置 于荧 光倒置 荧光显 微镜（FITC 荧光目 镜）下，观察 是否 出现绿色 荧光 信号。7.2 限制性 片段 长度 多态 性(RFLP)分析 7.2.1 DNA 的提 取 按照商 品化DNA 提取 试剂盒 说明书 提取病 毒细胞 培养 物中的 总DNA，以此 为模 板 分别扩 增Hexon基因的片段A和B。4 DB37/T 3128.12018 7.2.2 PCR 反应 体系 10PCR Buffer 2.5 L，dNTPs（2.5 mmol/L）2 L，上 游 引 物（50 mol/L）和下 游引物（50 mol/L）各0.5 L，DNA模板3 L，rTaq DNA 聚 合酶0.25 L，加ddH2O至25 L。7.2.3 PCR 反应 条件 94 C 预 变性5 min；94 30 s，50 30 s，72 2 min，进行30 个循 环；72 延伸10min。7.2.4 琼脂糖 凝胶 电泳 分别取18 L PCR 产物（片段A和片 段B）与2 L核 酸电泳 加样缓 冲液 混匀后，于1.5%琼 脂糖 凝胶中电泳，在位 于凝胶 中央 的孔加 入DNA 分子量 标准。加样后，按照5 V/cm电压，电泳20 min 40 min，每隔10 min 观 察一 次。7.2.5 琼脂糖 凝胶 电泳 成像 当加样 缓冲液 中溴 酚蓝电 泳过半 至凝胶 下2/5 处时，停止电 泳。将 琼脂 糖凝胶 置于凝 胶成像 仪下 观察。7.2.6 PCR 产物 纯化 按照琼 脂糖 凝胶 回收 试剂 盒说明 书对 阳性 条带 回收、纯化，溶 解于30L ddH2O 中。测定 核酸 浓度，确保核 酸浓 度10ng/L。7.2.7 分子克 隆测 序 将纯化 的核 酸片 段进 行常 规分子 克隆、测 序，获得 的Hexon基因 中片 段A 和 片段B的序 列。7.2.8 限制性 内切 酶酶 切 反应体 系：PCR 产 物（片段A或B）17 L、10 缓冲液2L、Hae 限 制 性内 切酶1L，总 体 积为20L。反 应条 件：37 孵育1 h，72 作用5 min。7.2.9 酶切产 物电 泳 取酶切 产物9L，按照7.2.4 的步 骤进 行琼 脂糖 凝胶 电泳。7.2.10 序列酶 切位 点分 析 用在线 软件NEB cutter2.0 分析片 段A 和 片段B中的Hae限制 性酶 切位 点。7.2.11 对照设 置 每次检 测，用 相应 的阳性 对照标 准品和 阴性 对照标 准品（LMH 细 胞），至少 设 置一个 或一个 以上 的阴性对 照和 阳性 对照。8 结果判 定 8.1 LMH 细胞 感染 I 群禽 腺病 毒，细 胞肿 胀变 圆，呈葡 萄串状，细 胞间 隙增 大，IFA 检测 出现 绿色 荧光信 号。在 阳性 对照 出现 绿色 荧 光信 号，阴性 对照 无条 带 出现（引 物二 聚体 除外）时，检测 样品 阳性的表明样品 中存 在I 群禽 腺病 毒，阴 性样 品中 无I 群禽 腺病毒。5 DB37/T 3128.12018 8.2 阳性对 照接 种细 胞出 现细 胞病变，IFA 检测 显示 胞浆出 现 绿色 荧光 信号（附 录C），阴性 对照 无细胞 病 变，胞浆 未出 现绿 色荧 光 信号 时，判定 检测 有效；否则 判定 检测 结果 无效，阳性 样品 用于 病毒的血清型鉴 定。8.3 以阳性 样品 培养 物的 总 DNA 为模 板，PCR 扩增 Hexon 基 因 的片段 A 和 B，经 限制 性酶切 多态 性分 析，与I 群禽 腺病 毒血 清分 型标 准 酶切 图谱（附录D）比对，确定 阳性 毒株 的血 清型。6 DB37/T 3128.12018 A A 附 录 A（规范 性附 录）相关试 剂的 配制 A.1 PBS溶液 的配 制：体系组成 含量 NaCl 3.9 g Na2HPO4 1 2H2O 0.2 g KH2PO4 0.2 g 双蒸馏水加至 1000 mL A.2 PBST溶液 的配 制：体系组成 含量 NaCl 3.9 g Na2HPO412H2O 0.2 g KH2PO4 0.2 g 吐温-20 0.5 mL 双蒸馏水加至 1000 mL A.3 50%甘油 体系组成 含量 甘油 50 mL 蒸馏水加至 100 mL 7