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ICS 65.020.30 B 41 DB37 山东省地方标准 DB 37/T 31122018 猪伪狂犬 病毒环介 导等温扩 增检测技 术 Loop-mediated isothermal amplification for Pseudorabies Virus 2018-02-02 发布 2018-03-02 实施 山东省质量技术监督局 发布 DB37/T 31122018 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省农业科学院畜牧兽医研究所。本标准起草人：李俊、时建立、彭喆、吴晓燕、张玲玲、郑书轩、徐绍建、孙文博、于江、丛晓燕、韩红、吴家强、杜以军、陈蕾、陈智、刘畅。I DB37/T 31122018 猪 伪狂犬 病毒环介 导等温 扩增检测 技术 1 范围 本标准规定了猪伪狂犬病毒（Pseudorabies Virus，PRV）的环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）检测技术的操作步骤。本标准适用于猪伪狂犬病毒的检测。2 规范性 引用 文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语与 定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 LAMP 环介导等温扩增技术。3.2 Bst DNA Polymerase 嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶。3.3 SDS 十二烷基硫酸钠。3.4 4S Green Plus Nucleic Acid Stain 无毒型核酸染色剂。4 材料及 设备 4.1 主要仪 器设 备 4.1.1 微量移液器（最大量程分别为10 L、20 L、100 L、1000 L），带滤芯的枪头。4.1.2 20000 r/min低温高速离心机。1 DB37/T 31122018 4.1.3 电热恒温水槽。4.1.4 稳流稳压电泳仪。4.1.5 水平电泳槽。4.1.6 凝胶成像系统。4.1.7 紫外透射反射分析仪。4.1.8 电磁炉。4.1.9 烧杯（1000mL）。4.1.10 电子天平 精度为：0.001g。4.2 主要试 剂或 材料 4.2.1 5mol/L Betaine 溶液：配制见附录 A.1。4.2.2 Bst DNA Polymerase（8U/L）。4.2.3 SYBR Green 核酸染料。4.2.4 0.5TBE缓冲液：配制见附录 A.2。4.2.5 2%琼脂糖电泳液：配制见附录A.3。4.2.6 4S Green Plus Nucleic Acid Stain。4.2.7 DNA Marker 2000。4.2.8 10%SDS 溶液：配制见附录A.4。4.2.9 超纯水：符合 GB/T 6682，三级。4.2.10 引物 猪伪狂犬病毒LAMP检测引物：F3：5-ACGAGCCCCGCTTCCA-3。B3：5-AGATGCAGGGCTCGTACA-3。FIP：5-AGACCACGCGCGCGGCATCAG-CTTCCACTCGCAGCTCTTCT-3。BIP：5-GAGAACTTCACCGCCACGCT-CGTAGTACAGCAGGCACCG-3。5 检测步 骤 5.1 样品采 集与 处理 采集血清或淋巴结、肝脏、肺脏、脾脏和肾脏等脏器。5.2 样品处 理 5.2.1 血清直接用于DNA 提取。5.2.2 淋巴结、肝脏、肺脏、脾脏和肾脏等脏器各 1 g剪碎放于灭菌的研磨器中磨碎，用生理盐水15倍稀释，取悬液反复冻融 3次，5000 r/min 离心15 min，取上清液-20 保存备用。5.3 病毒DNA 的提 取 5.3.1 取上清液（或血清）500 L加入10%SDS溶液 50 L、20 mg/mL蛋白酶 K溶液10 L，于 55 水浴2 h3 h。5.3.2 加入200 L Tris饱和酚，混匀，4 12000 r/min 离心15 min。5.3.3 取上清液 500 L，加入200 L Tris 饱和酚和 200 L三氯甲烷，4 12000 r/min离心15 min。2 DB37/T 31122018 5.3.4 取上清液 400 L，加入200 L 三氯甲烷，4 12000 r/min 离心 15 min。5.3.5 取上清液 300 L，加入2倍体积的无水乙醇，-20 静置 20 min，4 12000 r/min离心15 min。5.3.6 弃上清液，加入 1 mL 70%的乙醇冲洗沉淀表面及管壁，弃乙醇，晾干。5.3.7 加入20 L灭菌超纯水溶解沉淀，-20 保存备用。5.4 环介导 等温 扩增（LAMP）检 测 步骤 5.4.1 环介导等温扩增反应体系配制，按表1中 18 的循序配制。表1 环介导 等温 扩增 反应 体系（25 L）体系组成 体系含量 1 10ThermoPol 2.5 L 2 dNTP混合液(10 mmol/L)4.0 L 3 B3/F3(5 mol/L)0.15 L2 4 BIP/FIP(50 mol/L)1.5 L2 5 Betaine(5 mol/L)3.0 L 6 DNA 1.0 L 7 Bst DNA Polymerase(8 U/L)1 L 8 超纯水 10.2 L 5.4.2 LAMP程序设定 每次LAMP均应设一个阳性对照和阴性对照，具体参数见表2 表2 LAMP 反应 程序 设定 温度 时间 1 63 60 min 2 80 5 min 5.5 电泳 5.5.1 2%琼脂糖凝胶板的制备（见附录 A.3）。5.5.2 加样 将LAMP扩增产物5 L与1 L 6Loading Buffer混合，点样于1%琼脂糖凝胶孔中，以DNA Marker2000作相对分子质量指示。每次电泳加阳性对照和阴性对照的扩增产物作对照。5.5.3 电泳 保持稳定电压80 V，电泳20 min，观察结果。6 结果判 定 6.1 电泳结 果判 定 电泳反应结束后，如果阳性对照孔出现瀑布样条带，阴性对照孔不出现瀑布样条带，则试验成立。在试验成立条件下，出现瀑布样条带泳道的样品判为阳性（说明样品中含有猪伪狂犬病毒），不出现瀑布样条带泳道的样品为阴性（参见附录A.5）。3 DB37/T 31122018 6.2 可视化 结果 判定 6.2.1 LAMP反应体系中加入 1 L SYBR Green 核酸染料，混匀（加深观察颜色），阳性反应管内液体变为黄色，阴性反应管不发生颜色变化，为橘红色（参见附录A.6）。6.2.2 反应管置于紫外透射反射分析仪下，阳性反应管发出明亮的黄绿色荧光，阴性反应管不显现荧光（参见附录A.7）。4 DB37/T 31122018 A A 附 录 A（规范 性附 录）试剂的 配制 A.1 5mol/L Betaine 溶液 Betaine 1.4644 g。灭菌超纯水 2.5 mL。A.2 0.5TBE 缓冲 液 Tris 108 g。Na2EDTA.2H2O 7.44 g。硼酸 55 g。灭菌超纯水 定容至1 L，配成10TBE缓冲液。取10TBE缓冲液25 mL，加灭菌水475 mL，制成0.5倍的工作液。A.3 2%琼脂 糖电 泳液 琼脂糖 1.2 g。0.5TBE缓冲液 60 mL。A.4 10%SDS 溶液 SDS 1 g。灭菌超纯水定容至 10 mL。A.5 LAMP反应 电泳 检测 结果 5 DB37/T 31122018 M：DL-2000；1、2、3、5、6：PRV阳性样品；4、7：PRV阴性样品；P：Positive control；N：Negative control。A.6 LAMP反 应肉 眼观 察的 可视 化结果 1：Positive control；2：PRV 阳性反应管；N：Negative control。A.7 LAMP反应 紫外 透射 反射 分析 仪 下可 视化 结果 1：Positive control；2：PRV 阳性反应管；N：Negative control。_ 6
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