蜜蜂以色列急性麻痹病毒病诊断技术DB35／T 1854-2019.pdf

ICS 11.220 B 41 DB35 福建省地方标准 DB35/T 18542019 蜜蜂以色列急性麻痹病毒病诊断技术 Diagnostic techniques for Israeli acute paralysis virus of honey bees 2019-09-11发布 2019-12-11实施福建省市场监督管理局 发布 DB35/T 18542019 I 目 次 前言.II 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 缩略语.1 4 疾病概述.1 5 临床诊断.2 6 实验室诊断.2 7 结果判定.5 附录 A（规范性附录）溶液的配制.7 附录 B（资料性附录）参考序列.8 附录 C（资料性附录）核酸扩增电泳图.9 DB35/T 18542019 II 前 言 本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准由福州海关提出并归口。本标准起草单位：福州海关、海口海关、福建农林大学、长春海关、厦门瑞德利校准检测技术有限公司、东莞市中鼎检测技术有限公司、福建省国鼎检测技术有限公司。本标准主要起草人：张体银、郑腾、李丹丹、王武军、张志灯、黄少康、宋战昀、廖善胜、白泉阳、林杰、于师宇、曹维强、李厚标。DB35/T 18542019 1 蜜蜂以色列急性麻痹病毒病诊断技术 1 范围 本标准规定了蜜蜂以色列急性麻痹病毒病的疫病概述、临床诊断、实验室诊断和结果判定。本标准适用于蜜蜂以色列急性麻痹病毒病的诊断和蜜蜂以色列急性麻痹病毒感染的监测。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 66822008 分析实验室用水规格和试验方法 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。Ct值：循环阈值（Cycle Threshold）DEPC：焦碳酸二乙酯（Diethy Pyrocarbonate）dNTP：三磷酸脱氧核苷酸（Deoxynucleoside Triphosphate）EB：溴化乙锭（Ethidium Bromide）IAPV：以色列急性麻痹病毒（Israeli Acute Paralysis Virus）RNA：核糖核酸（Ribonucleic Acid）RT-PCR：逆转录聚合酶链式反应（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction）TBE：三羟甲基氨基甲烷-硼酸-乙二胺四乙酸（Trihydroxymethyl Aminomethane-Boric Acid-ethylene Diamine Tetraacetic Acid）4 疾病概述 以色列急性麻痹病毒病是由IAPV引起的一种常见的蜜蜂病毒病，可侵染各个发育时期的蜜蜂个体（卵、幼虫、蛹、成蜂）和蜂群各级型蜜蜂（工蜂、雄蜂和蜂王），给蜂群造成重大损失，对蜜蜂养殖业危害大，目前该病在全球大部分地区分布。IAPV属于小核糖核酸病毒总科（Picornaviridae），病毒基因组是由9 487个核糖核苷酸组成，它的两个开放读码框被一个由184个核苷酸组成的基因间区域分开。靠5端的开放读码框编码翻译与RNA复制和蛋白质加工相关的、由1 900个氨基酸构成的非结构性多聚蛋白质，靠3端的开放读码框编码翻译用于加工不同衣壳蛋白的、由944个氨基酸组成的结构性多聚蛋白。IAPV有两个内核糖体进入位点，一个位于5端非翻译区，另一个位于两个开放阅读框之间的基因间区域，在衣壳蛋白的起始翻译合成时起介导作用。内核糖体进入位点介导的翻译起始机制降低了病毒对寄主的依赖性，这种机制被认为是病毒破坏宿主蛋白质翻译合成过程的方式之一。DB35/T 18542019 2 5 临床诊断 5.1 临床表现 5.1.1 临床健康的蜂群短时间内大量成年工蜂突然消失。5.1.2 在巢脾上只剩下蜂王、幼虫和一些未成年工蜂以及花粉等残留食物，且在蜂箱内并无死亡蜜蜂的残存尸体，也没有其他寄生害虫的存在。5.1.3 蜜蜂个体感染早期腹部、胸部逐渐变黑，翅膀颤抖，在蜂箱外的空地上转圈，既不采食也不能飞行。5.1.4 蜜蜂感染后期胸部绒毛脱落，最后麻痹抽搐而死。5.2 初步诊断 当蜂群出现5.1中部分或全部临床表现时，可做出初步诊断，确认需要进行实验室诊断。6 实验室诊断 6.1 设备、材料和试剂 6.1.1 设备 6.1.1.1 普通 PCR 扩增仪。6.1.1.2 荧光 PCR 仪。6.1.1.3 台式冷冻高速离心机（12 000 r/min）。6.1.1.4 微量移液器（0.5 L10 L、2 L20 L、20 L200 L、100 L1000 L）。6.1.1.5 水平电泳仪。6.1.1.6 凝胶成像系统。6.1.1.7 电子天平（感量 0.01 g）。6.1.1.8 冰箱（2 8 和80）。6.1.2 材料和试剂 6.1.2.1 试验用水应符合 GB/T 66822008 中一级水的规定。6.1.2.2 焦炭酸二乙酯处理水（DEPC 水）。6.1.2.3 Trizol 试剂。6.1.2.4 三氯甲烷。6.1.2.5 异丙醇。6.1.2.6 无水乙醇。6.1.2.7 10One Step RNA PCR Buffer。6.1.2.8 MgCl2。6.1.2.9 dNTPs（含dATP、dTTP、dGTP、dCTP）。6.1.2.10 逆转录酶。6.1.2.11 Taq DNA 聚合酶。6.1.2.12 琼脂糖。6.1.2.13 分子量标准（100 bp1 000 bp）。6.1.2.14 TBE 电泳缓冲液，配制方法按附录 A中 A.1 的规定。DB35/T 18542019 3 6.1.2.15 EB（10 mg/mL），配制方法按附录 A中 A.2 的规定。6.1.2.16 上样缓冲液，配制方法按附录 A 中A.3 的规定。6.1.2.17 DNA 纯化回收试剂盒。6.2 引物、探针序列和对照样品 6.2.1 引物和探针序列 6.2.1.1 普通 RT-PCR引物序列 IAPV-F1 5-AAG GCT CAG CTA GGA TGA CAC-3。IAPV-R1 5-TCA GGA TTT AAA GCC TCA CG-3。扩增片段约270 bp，用双蒸水溶解至10 mol/L后，保存于-20 备用。6.2.1.2 荧光 RT-PCR引物和探针序列 上游引物 IAPV-F2 5-ACT AGT GGA CGA AGC GAG TT-3。下游引物 IAPV-R2 5-TGT ACT GGG CAG TTA CAG CA-3。探针IAPV-P序列为 5-FAMCGG AAC GCC GCA TGT GTT ACC ABHQ1-3。扩增片段约127 bp，用双蒸水溶解至10 mol/L后，保存于-20 备用。6.2.2 对照样品 6.2.2.1 阳性对照为灭活的 IAPV或单一感染 IAPV 的蜜蜂组织或含目的片段的 RNA。6.2.2.2 阴性对照为灭活的其他蜜蜂病毒或未感染 IAPV的蜜蜂组织或不含目的片段的 RNA。6.2.2.3 空白对照用无菌水代替样品。6.3 样品采集和保存 选择疑似感染的蜂群，挑取带有临床表现的蜜蜂或新鲜死亡蜜蜂1020只；也可挑取单个病、死虫或蛹23只装入无菌的小试管内；发现患病蜂王也可采取单个蜂王个体。若样品24 h内能送达实验室，应2 8 保存；若样品24 h内不能送达实验室，则应-20 或更低温度保存。对于无临床表现的蜂群也可采用上述采样和保存方法。6.4 IAPV的RT-PCR检测 6.4.1 RNA提取 选取不超过200 mg300 mg待鉴定幼虫虫体或成蜂蜂体，置于DEPC水处理过的研钵中，加入液氮进行研磨，将研磨得到的粉末，快速转移至无RNA酶并经过液氮冷却的1.5 mL离心管中，加入1 mL Trizol试剂，用移液器充分吹打1020次，室温放置5 min；加入200 L三氯甲烷，旋涡振荡30 s混匀，室温放置15 min；4，12 000 r/min离心15 min；取上层水相至一新的离心管中，加等体积异丙醇，上下颠倒数次混匀，-20 放置20 min；4，12 000 r/min离心15 min；弃上清液，沉淀用1 mL 75%乙醇清洗；4，10 000 r/min离心10 min，弃上清液，沉淀室温干燥5 min；加20 L DEPC水溶解RNA沉淀。-80 冰箱保存备用，RNA溶液应避免反复冻融，并尽快用于检测。RNA提取也可采用其他等效的提取方法或等效的商品化RNA提取试剂盒。DB35/T 18542019 4 6.4.2 RT-PCR反应 取PCR反应管，按表1的规定配制反应体系，加样宜按空白对照、阴性对照、待检样品、阳性对照的次序分别加入模板，盖上管盖，充分混匀。表1 IAPV RT-PCR 反应体系(25 L)组分 加样量 L 终浓度 10One Step RNA PCR Buffer 2.5 1 MgCl2（25 mmol/L）2.5 2.5 mmol/L dNTPs（10 mmol/L each）0.5 0.2 mmol/L RNase Inhibitor（40 U/L）0.5 0.8 U/L 逆转录酶（5 U/L）0.5 0.1 U/L Taq DNA 聚合酶（5 U/L）0.5 0.1 U/L 引物IAPV-F1（10 mol/L）1.0 0.4 mol/L 引物IAPV-R1（10 mol/L）1.0 0.4 mol/L DEPC水 13/模板/对照 3/将已加样的PCR反应管短暂离心后放入PCR仪，扩增反应条件设定为：60 反转录30 min；95 预变性2 min；之后95 变性30 s，55 退火30 s，72 延伸45 s，运行35个循环；72 补充延伸10 min，4 保温。以水作为空白对照，同时设阳性对照和阴性对照。6.4.3 琼脂糖凝胶电泳 用TBE电泳缓冲液配制1.5%的琼脂糖凝胶平板，其中含有1 g/mL EB（或与EB等效的商品化核酸染料）。将平板放入水平电泳槽，使电泳缓冲液刚好淹没胶面。将6 L PCR产物和2 L上样缓冲液混匀后加入样品孔中进行电泳。在电泳时设立DNA标准分子量作对照。5 V/cm电泳约0.5 h，当溴酚蓝到达底部时停止。6.4.4 测序 使用凝胶成像分析系统观察核酸条带并判断结果，经核酸扩增电泳后如出现一条大小约270 bp的DNA片段，应对其切胶回收后进行测序，也可直接送PCR产物进行测序，参考序列参见附录B，同源性达到95%以上方可判为核酸阳性。6.4.5 判定依据 经核酸扩增电泳后阳性对照出现一条大小约270 bp的DNA条带，阴性对照和空白对照无该目的条带，才可判定试验成立，参见附录C中的图C.1。待检样品经核酸扩增电泳后，在大小约270 bp DNA位置上有条带并经测序验证者为核酸阳性，无条带或条带的大小不是约270 bp的为核酸阴性。DB35/T 18542019 5 6.5 IAPV的实时荧光 RT-PCR检测 6.5.1 实时荧光 RT-PCR反应 取PCR反应管，按表2的规定配制反应体系，加样宜按空白对照、阴性对照、待检样品、阳性对照的次序分别加入模板，盖上管盖，充分混匀。表2 IAPV实时荧光 RT-PCR反应体系(25 L)组分 加样量 L 终浓度 10One Step RNA PCR Buffer 2.5 1 MgCl2（25 mmol/L）2.5 2.5 mmol/L dNTPs（10 mmol/L each）0.5 0.2 mmol/L RNase Inhibitor（40 U/L）0.5 0.8 U/L 逆转录酶（5 U/L）0.5 0.1 U/L Taq DNA聚合酶（5 U/L）0.5 0.1 U/L 引物IAPV-F2（10 mol/L）0.5 0.2 mol/L 引物IAPV-R2（10 mol/L）0.5 0.2 mol/L 探针IAPV-P（10 mol/L）0.5 0.2 mol/L DEPC水 14/模板/对照 2.5/将已加样的PCR反应管短暂离心后放入PCR仪，扩增反应条件设定为：60 反转录30 min；95 预变性2 min；之后95 变性15 s，60 退火30 s，收集荧光，共40个循环。同时设阳性、阴性对照和空白对照。6.5.2 判断依据 综合分析仪器给出的各项结果，基线以仪器给出的默认值作为参考，阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点为准，具体根据仪器噪音情况进行调整，选择FAM通道进行分析。阳性对照样品有对数扩增曲线，而且Ct值30；阴性对照和空白对照无扩增曲线，而且Ct值40或未检出，二者均成立才可判定试验成立。检验样本Ct值35时，报告IAPV核酸阳性。检验样本35Ct值40时，重复一次，如果Ct值仍然40，并且曲线有明显的对数增长期，报告IAPV核酸阳性，否则报告IAPV核酸阴性。检验样本Ct值为零或Ct值40时，报告IAPV核酸阴性。7 结果判定 7.1 若有临床表现，经 RT-PCR 和/或实时荧光 RT-PCR检测为核酸阳性，判定为蜜蜂以色列急性麻痹病毒病。7.2 若有临床表现，经 RT-PCR 和实时荧光 RT-PCR 检测为核酸阴性，判定为未感染蜜蜂以色列急性麻痹病毒，需进一步做其他病检查。DB35/T 18542019 6 7.3 若无临床表现，经 RT-PCR 和/或实时荧光 RT-PCR检测为核酸阳性，判定为蜜蜂以色列急性麻痹病毒隐性感染。7.4 若无临床表现，经 RT-PCR 和实时荧光 RT-PCR 检测为核酸阴性，判定为未感染蜜蜂以色列急性麻痹病毒。DB35/T 18542019 7 A A 附 录 A（规范性附录）溶液的配制 A.1 TBE电泳缓冲液(5倍浓缩液)三羟甲基氨基甲烷（Tris）54.0 g 硼酸 27.5 g 乙二胺四乙酸（EDTA）2.9 g 蒸馏水 定容至1 000 mL 用5 mol/L的盐酸(HCl)调pH至8.0。A.2 EB(核酸染色剂)EB 100 mg 蒸馏水 10 mL 用蒸馏水配制成10 mg/mL的浓缩液。用时每100 mL染色液中加10 L的浓缩液。A.3 上样缓冲液 溴酚蓝 0.25 g 蔗糖 40 g 蒸馏水 100 mL 溶解混匀后121 高压灭菌15 min。DB35/T 18542019 8 B B 附 录 B（资料性附录）参考序列 B.1 RT-PCR扩增的IAPV基因序列（共 270 bp）aaggctcagctaggatgacacgcctgtacactgtcgacattagttaagttacaattacacgtcttttgccgaagaaaccattttagtcaactgattatgatttttgtataacgacaaacagtgatgaactgtataactcatcaataacaaaatggattacgaacctatttgtaactatcttgatcgaagtctagtagatccccaatatagccctgaaaagcttgagggacgagatagctctataaatagacgtgaggctttaaatcctga B.2 实时荧光RT-PCR扩增的IAPV基因序列（共 127 bp）actagtggacgaagcgagttccgtattgtgtacgttgggagtattgctttcttgttgtgaatcaccaggcatgatatttcggaacgccgcatgtgttaccatacgactgctgtaactgcccagtaca DB35/T 18542019 9 C C 附 录 C（资料性附录）核酸扩增电泳图 核酸扩增电泳图参见图C.1。说明：N阴性对照；P阳性对照；M100 bp DNA Ladder；1IAPV阳性样品；2IAPV阴性样品；3空白对照（无菌水）。图C.1 核酸扩增电泳图 _ 500 bp 300 bp 100 bp N P M 1 2 3 D B 3 5/T 1 8 5 4 2 0 1 9福 建 省 地 方 标 准蜜 蜂 以 色 列 急 性 麻 痹 病 毒 病 诊 断 技 术D B3 5/T 1 8 5 42 0 1 9*2 0 1 9 年 9 月第一版 2 0 1 9 年 9 月第一次印刷