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ICS 65.020.01 B 16 DB15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 1604 2019 马铃薯晚 疫病菌分 离保存与 生理小种 鉴定技术规程 Technical Regulation for the isolation and race detection of phytophthora infestans on Potato 2019-03-15 发布 2019-06-15 实施 内 蒙 古 自 治 区 市 场 监 督 管 理 局 发布 DB15/T 1604 2019 I 目 次 前 言.II 1 范围.1 2 术 语和 定义.1 3 培 养基 的配 置.2 4 病 样采 集.2 5 晚 疫病 菌的 分离 纯化 与 鉴定.2 6 鉴 别寄 主的 准备.3 8 病 情调 查.3 10 菌 株保 存.3 11 鉴 定后 材料 的灭 活处 理.4 附 录A（资 料性 附录）马铃薯 晚疫 病菌（致 病疫 霉菌）菌落 培养 特征 及孢 子囊形 态特 征.5 附 录B（规 范性 附录）马铃薯 晚疫 病菌 生理 小种 命名方 法.6 DB15/T 1604 2019 II 前 言 本标准 依据GB/T1.1-2009 给出规 则起 草。本标准 由赤 峰市 农牧 科学 研究院 提出。本标准 由自 治区 农业 标准 化技术 委员 会（SAM/TC 20）归口。本标准 起草 单位：赤 峰市 农牧科 学研 究院。本标准 主要 起草 人：郝永 丽、王 雪洁、高 博、胡海 波、张 金成、刘 庆鹏。DB15/T 1604 2019 1 马 铃薯晚 疫病菌分 离保存 与生理小 种鉴定 技术规程 1 范围 本标准 规定 了马 铃薯 晚疫 病菌分 离保 存与 生理 小种 鉴定的 培养 基的 配置、病 样采集、晚 疫病 菌的 分离纯化 与鉴 定、鉴别 寄主 的准备、人 工接 种、病 情 调查、生理 小种 确定、菌 株保存、鉴 定后 材料 的灭 活处理等 内容。本标准 适用 于马 铃薯 晚疫 病菌分 离保 存与 生理 小种 室内鉴 定。2 术语和 定义 下列术 语和 定义 适用 于本 文件。2.1 生理小 种 physiological race 病原物 的种或 变种(或专 化 型)内,在 形态 上相似 而在 培养性 状、生 理、生化、病理(致 病力)或其 他特性上 有差 异的 生 物 型或 生物型 群。2.2 单孢分 离 single spore isolation 在实体 解剖 镜下 直接 挑取 单个孢 子，一定 条件 下培 养萌发 成菌 丝体 来获 得纯 菌种的 方法。2.3 鉴别寄 主 differentiate host 一套分 别含 有 R1 R11 主 效抗性 单基 因和 不 含 R 基 因作为 对照（r）的马 铃薯 品种。2.4 人工接 种鉴 定 artificial inoculation 在人工 控制 的条 件下，用 马铃薯 晚疫 病菌 孢子 悬浮 液接种 到马 铃薯 鉴别 寄主 的离体 叶片 上，根据 接种叶片 的孢 子囊 产生 状况 及在不 同鉴 别寄 主上 的组 合情况 确定 菌株 具体 所属 的生理 小种。2.5 接种体 inoculant 用于人 工接 种鉴 定用 的马 铃薯晚 疫病 菌（Phytophthora infestans）孢 子悬 浮 液。DB15/T 1604 2019 2 2.6 离体叶 片接 种法 leaf inoculate in vitro 将接种 体接 种到 鉴别 寄主 植株 中 部复 叶摘 下的 小叶 片 的方 法。3 培养基 的配 置 3.1 黑麦培 养基 将黑麦50 g 加适 量自 来水 室温下 浸泡20 h 36 h，匀浆机 捣碎，55 60 水浴1 h 2 h，四 层纱布过 滤，上清 液补 水至1000 mL，加 入琼 脂粉12 g，分装 后121 高压 灭菌25 min。3.2 选择性 培养 基 在冷却 至40 左右 的黑 麦 培养基 中加 入利 福平20 mg L-1 或 氨卞 青霉 素200 mg L-1 或70%五 氯硝 基苯100 mg L-1。4 病样采 集 在晚疫 病发 生时 期，采集 具有典 型症 状的 新鲜 病叶，记录 品种、采 样时 间、采样地 点。用保 鲜袋 或薯片夹 叶带 回实 验室，贮 放在4 冰 箱中 备用。5 晚疫病 菌的 分离 纯化 与鉴 定 5.1 保湿培 养分 离法 将采回 的病 叶用 水冲 洗干 净，晾 干后，叶 背朝 上放 入垫有 湿滤 纸的 培养 皿内，盖盖 后置 于 18 20 培养 箱内 培养1 d 2 d。然后 挑取 病斑 上的 霉 层置于 选择 性培 养基 上，18 20 培 养7 d 9 d，待 菌落 直径 长至2 cm 3 cm，备 用。5.2 薯片夹 叶分 离法 取感病 品种 的健 康薯 块清 洗干净，晾 干，用 75%的 乙醇溶 液浸 泡 30 s 40 s，取出，烧 干表 面 残存的乙 醇。将薯 块切 成约 5 mm 厚 的薯 片，放在 已灭 菌的培 养皿 中。取约 1 cm2的 病健 交界 处的 病叶 组织置于 已消 毒的 两薯 片之 间，18 20 培养 箱 内培养，待薯 片长 出霉 层 后，挑取 霉层 接种 于选 择 性培养基 中培 养备 用。5.3 纯化 经单孢 分离 后挑 取单 孢菌 落，置 于选 择性 培养 基上 培养备 用。5.4 鉴定 挑取分 离的 少量 培养 体制 成玻片，在 100 倍 显微 下 观察菌 体形 态。当 菌体 形 态与附录 A 相符 时，则确定该 分离 物为 晚疫 病菌。DB15/T 1604 2019 3 6 鉴别寄 主的 准备 将鉴别 寄主 的脱 毒苗 移接 于 MS 培养 基上，15 d 20 d 后移 栽到 无土 基质 中，浇 施营养 液，在20 23 下培 养约30 d 后备 用。7 人工接 种 7.1 孢子 悬浮 液的 制备 将供试 病原 菌接 种在 黑麦 培养基 上，18 20 培养7 d 10 d，待大 量产 生孢子 囊后，用 无 菌水冲洗，制 成菌 悬液，用 2 层纱 布过 滤获 得孢 子囊 悬液，置 于 4 冰 箱 2 h 3 h，待 释放 出游 动孢 子后，再 用孔 径为 12 m 的 钢丝网 过滤 除去 孢子 囊和 空孢子 囊壳，然 后经 血球 计数板 测数 并将 其浓 度调至约4 104 个/mL，备用。孢子 悬液 当天 使用 当天 制备。7.2 接种 7.2.1 接种 技术 摘取鉴 别寄 主植 株中 部复 叶的小 叶片，背 面朝 上置 于 1.5%的 水琼 脂培 养基 平 板中，编号 备用。采用离体 叶片 接种 法，用微 量移液 器吸 取20 L 配 制 好的接 种体，滴 在每 个小 叶背面 近中 脉两 侧。每菌株每鉴 别寄 主接 种3 片叶，重 复 3 次，以 无菌 水处 理为对 照。7.2.2 培养 条件 接种后 的叶 片置 于18 20 的 光照 培养 箱中 培 养。次 日，将叶 面翻 转，相同条 件下 继续 培养。8 病情 调查 8.1 调查时 间 接种5 d 7 d 后 观察 并记 录病情。8.2 病情调 查方 法 根据接 种部 位症 状及 是 否 产生孢 子囊 确定 鉴别 寄主 抗、感病 型。先观 察接 种 部位症 状产 生情 况，再用低倍 显微镜 观察 症状部 位。各 处理每 次重 复的叶 片2/3或 全部 有症状 且产 生 孢子囊 的判定 为感 病型，即该菌 株对 该寄 主有 毒力；全部 叶片 无症 状或 有轻 微症状 但无 孢子 囊产 生的 为抗病 型。同一 处理次重复的结 果不 一致 视为 无效 处理。9 生理小 种确 定 根据供 试菌 株在 鉴别 寄主 上的抗、感病 型确 定所 属 生理小 种。各 生理 小种 在 鉴别寄 主上 的抗、感病型模式 见附 录B。10 菌株 保存 将经过 接种 鉴定 确定 为马 铃薯晚 疫病 菌并 且纯 化的 菌株转 移到 黑麦 斜面 培养 基培养，当 斜面 上长 满菌丝后，灌 注灭 菌过 的液 体石蜡 密封，置 于 13 黑暗中 保存。DB15/T 1604 2019 4 11 鉴定后 材料 的灭 活处 理 将接种 后剩 余的 接种 体、接种鉴 定后 的植 株残 留物 等集中 到容 器中 经121、20 min 灭活 处理。DB15/T 1604 2019 5 A A 附 录 A（资料 性附 录）马铃薯 晚疫 病菌（致 病疫 霉菌）菌落 培养 特征 及孢 子囊形 态特 征 马铃薯 晚疫 病菌（致 病疫 霉菌）菌落 为白 色棉 絮状（见图 A.1）。菌丝 为无 色、无 隔膜。孢 囊梗 无色，具 34 分 枝，在产 生 每个孢 子囊 的部 位，孢囊 梗膨大 成节 状，节基 部钝 圆而顶 端尖 细。孢子 囊单胞无色，卵 圆形，顶 端有 乳状突 起（见图 A.2）。图A.1 马铃薯 晚疫 病菌（致 病疫 霉菌）菌落 形态 图A.2 马铃薯 晚疫 病菌（致 病疫 霉菌）菌丝 及孢 子囊 形态 DB15/T 1604 2019 6 B B 附 录 B（规范 性附 录）马铃薯 晚疫 病菌 生理 小种 命名方 法 根据各 供试 菌株在11个 含 抗性单 基因的 鉴别 寄主上 的表现 症状来 进行 马铃薯 晚疫病 菌生理 小种 命名，所 有的生 理小 种均能 侵染不 具任何 抗性 基因的 品种（r）,如 生理小 种1.2.3.4，则表明 该生 理小 种除了能 侵染 不具 任何 抗性 基因的 品种（r）外，还 可侵 染 R1、R2、R3 和 R4，并表 现出发 病症 状，而 对 R5、R6、R7、R8、R9、R10 和 R11 均 不能 侵染，不能 表现 发病症 状；如生 理小 种 3.7.8.10.11，则表 明该生理小种 除了能 侵染 不具任 何抗性 基因的 品种（r）外，还可 侵染 R3、R7、R8、R10 和 R11，并表现 出发病症状，而对 R1、R2、R4、R5、R6 和 R9 均 不能侵 染，不 能表现 发病 症状；依此类 推，进 行马 铃薯晚疫病菌 生理 小种 鉴定。_
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