番鸭呼肠孤病毒RT-PCR检测方法DB35／T 1327-2013.pdf

ICS 07.080 B41 DB35 福建省地方标准 DB35/T 13272013 番鸭呼肠孤病毒RT-PCR检测方法 2013-02-20发布 2013-05-20实施福建省质量技术监督局 发布 DB35/T 13272013 I 目 次 前言.II 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 方法原理.1 4 实验室准备.1 5 实验室条件.2 6 操作程序.2 7 分析判定.2 8 样品无害化处理.3 附录 A（规范性附录）试剂的配制.4 附录 B（资料性附录）番鸭呼肠孤病毒 S1 基因序列.6 参考文献.7 DB35/T 13272013 II 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写给出的规则编写。本标准由福建省农业厅提出并归口。本标准由福建省农业科学院畜牧兽医研究所负责起草。本标准主要起草人：林锋强，陈少莺，胡奇林，陈仕龙，王劭，程晓霞，朱小丽，李兆龙，黄冬菊，陈建翊。DB35/T 13272013 1 番鸭呼肠孤病毒 RT-PCR 检测方法 1 范围 本标准规定了应用 RT-PCR 方法检测番鸭呼肠孤病毒的材料准备、操作方法、结果判定及样品无害化处理。本标准适用于番鸭呼肠孤病毒的检测。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法 3 方法原理 将番鸭呼肠孤病毒RNA基因逆转录为互补DNA，以此为模板，利用番鸭呼肠孤病毒（muscovy duck reovirus，MDRV）S1基因序列（见附录B）设计的一对引物,进行PCR特异性扩增，扩增与预期大小300bp相符的片段，对病毒核酸进行定性。4 实验室准备 4.1 微量移液器 4.2 高速冷冻离心机 4.3 聚合酶链式反应仪 4.4 电泳仪 4.5 凝胶成像系统 4.6 PBS(0.01mol/L pH7.2)配制方法按附录 A中 A.2 进行。4.7 TRIzol 试剂 4.8 三氯甲烷（分析纯）4.9 异丙醇（分析纯）4.10 无水乙醇（分析纯）4.11 50TAE缓冲液 配制方法按附录 A 中A.3 进行。DB35/T 13272013 2 4.12 电泳级琼脂糖 配制方法按附录 A 中A.4 进行。4.13 AMV 反转录酶 4.14 RNA 酶抑制剂 4.15 Taq DNA聚合酶 4.16 SYBR 荧光染料 配制方法按附录 A 中A.5 进行。4.17 上样缓冲液 配制方法按附录 A 中A.6 进行。4.18 灭菌双蒸馏水 配制方法按附录 A 中A.7 进行。4.19 MgCl2溶液 4.20 5反转录反应缓冲液 配制方法按附录 A 中A.8 进行。4.21 Random 9mers 配制方法按附录 A 中A.9 进行。4.22 2.5mmoL dNTPs 配制方法按附录 A 中A.10 进行。4.23 10PCR Buffer 配制方法按附录 A 中A.11 进行。4.24 引物 配制方法按附录 A 中A.12 进行。4.25 DNA 分子量标准(DL2000)4.26 MDRV 细胞毒 配制方法按附录 A 中A.13 进行。注：建议使用经验证有效的商品化核酸提取、反转录、聚合酶链式反应试剂盒，配合本标准开展RT-PCR检测。5 实验室条件 RT-PCR 实验室应划分出 RNA 提取区、基因扩增区、电泳区。6 操作程序 6.1 样品的采集和处理 无菌采集病鸭或病鹅的样品（肝、脾、血液、分泌物或排泄物等），加无菌 PBS（0.01mol/L pH7.2）制成 10悬液，冻融 3次，3000 g 离心 20min，取上清液，待提取 RNA。1)1)检测后的样品应进行高压消毒无害化处理。DB35/T 13272013 3 6.2 实验对照 设立阳性对照、阴性对照。6.3 RNA 的提取 每个样品取250 L上清液加入750 LTRIzol试剂，反复摇匀；室温（1530）放置5min；加入150L氯仿，剧烈振荡15s，室温放置3 min；2810000 g离心15 min，RNA主要在上层水相中；把水相转移到新管中，加入600 L异丙醇沉淀RNA，室温放置10 min；2810000 g离心10 min，移去上清；加入1mL无水乙醇洗涤RNA沉淀，28不超过7500 g离心5 min，弃上清；沉淀室温放置，风干5min10 min。加入30 L灭菌双蒸馏水溶解，-20保存，备用。6.4 反转录操作 在PCR管中依次加入：MgCl2溶液(25mmol/L)2 L；5反转录反应缓冲液2 L；dNTPs(2.5mmol/L)1 L；Random 9mers(50pmol/L)0.5 L；RNA酶抑制剂(40U/L)0.25L；AMV反转录酶(40U/L)0.5 L；样品RNA 1 L；灭菌双蒸水调至总体积10 L。加样完毕后，12000 g离心15s，放置于PCR仪内，按下面程序进行反转录：30 10min，42 30min，99 5min，4结束反应。6.5 PCR 检测操作 在PCR管中依次加入：RNA反转录产物10 L；MgCl2溶液(25mmol/L)2 L；10PCR Buffer 5 L；上游引物(50pmol/L)1 L；下游引物(50pmol/L)1 L；Taq酶（5U/L）0.25 L；灭菌双蒸水补足至总体积为50 L。加完试剂后离心混合，将PCR管置于PCR仪内，按下面程序进行PCR反应：94预变性5min；然后进入941min，55 1min，721min的循环，共循环35次；72延伸10min；4结束扩增。PCR产物电泳或保存在4冰箱。6.6 电泳 6.6.1 制备 1%琼脂糖凝胶，配制见附录 A.3。6.6.2 分别取10 L PCR 产物和分子量标准与 1 L 上样缓冲液混合，加入琼脂糖凝胶板加样孔。6.6.3 5V/cm 电压电泳，30min。7 结果判定 7.1 电泳后的凝胶用紫外凝胶成像仪扫描图片。7.2 用 DNA 分子量标准比较判断 PCR 产物片断大小。7.3 在阳性对照孔出现 300bp 扩增带，阴性对照无此扩增带时判定结果。7.4 待检样品扩增产物出现 300bp 扩增带时，判定为番鸭呼肠孤病毒核酸阳性，否则判定为阴性（图 1）。DB35/T 13272013 4 图 1：RT-PCR 方法检测MDRV 样品结果 1-2 阴性对照；3-4阳性对照；M分子量标准 DB35/T 13272013 5 A 附 录 A（规范性附录）试 剂 的 配 制 A.1 实验室用水均采用GB/T 6682-2008 标准（三级水级别），所有试剂均为分析纯（AR）。推荐使用经验证有效的商品化试剂。A.2 PBS溶液(0.01mol/L pH7.2）称取下列试剂，置于 1 L 烧杯中。N aCl 8g KCl 0.2g Na2HPO4.12H2O 3.58g KH2PO4 0.27 g 向烧杯中加入约800mL的去离子水，充分搅拌溶解；滴加浓盐酸调节pH值至7.2，然后加入去离子水定容至l L；高温高压灭菌后，室温保存。A.3 50TAE电泳缓冲液配制 A2.1 0.5mol/L乙二铵四乙酸二钠(EDTA)溶液(pH8.0)乙二铵四乙酸二钠 1 8.6 1 g 去离子水 80m L 氢氧化钠 调 pH至 8.0 去离子水 加至 100mL A2.2 TAE 电泳缓冲液(50)配制 羟基甲基氨基甲烷(T r is)24 2 g 冰乙酸 5 7.1 m L 0.5mol/LEDTA溶液(pH8.0)100m L 去离子水 加至 1000mL 用时用灭菌双蒸水稀释使用。A.4 1%琼脂糖凝胶的配制 琼脂糖 1.0 g 1T A E电泳缓冲液 加至 100mL 微波炉中完全融化，摇匀，倒入电泳板中，凝固后取下梳子，备用。A.5 SYBR Green I荧光染料溶液 用 1TAE电泳缓冲液将 SYBR Green I荧光染料稀释 100 倍，28避光冷藏。DB35/T 13272013 6 A.6 10上样缓冲液 聚蔗糖（400型）2 5g 去离子水 1 0 0m L 溴酚蓝 0.1g 二甲苯青 0.1g S Y BR G r een I荧光染料溶液（A.4）1 0m L A.7 灭菌双蒸水 超纯水 1 00m L 焦碳酸二乙酯（DEPC）5 0 L 室温过夜，121高压 15min，分别装到 1.5mL DEPC 处理过的微量管中。A.8 5反转录反应缓冲液 1 m ol/L T r is-H Cl（pH8.3）5m L K Cl 0.5 5 9g D TT 0.154g 灭菌双蒸水 加至 100mL A.9 Random 9mers 50nmol Random 9mers加入灭菌双蒸水 1mL,充分溶解后-20保存备用。A.10 2.5mmol dNTPs DATP（10mmol/L）2 0 L DTTP（10mmol/L）2 0 L DGTP（10mmol/L）2 0 L DCTP（10mmol/L）2 0 L A.11 10PCR Buffer（无Mg2+）1mol/L Tris-HCl（pH8.3）5m L 1m o l/L K C l 5 0 m L N o n ide t P 4 0 0.8 m L 灭菌双蒸水 加至 100mL A.12 PCR引物 用灭菌双蒸水将引物稀释成 50pmol/L，扩增片断为 300bp DB35/T 13272013 7 上游引物：5 GCATGAACATGCCAGTTGAG3 下游引物：5 AAGCCATAACGATGGCAGTC3 A.13 MDRV细胞毒 将番鸭呼肠孤病毒 MW9710 株接种番鸭胚成纤维（MDEF）细胞，当细胞病变达 80%以上，收集细胞培养液，-20保存备用。DB35/T 13272013 8 B A 附 录 B（资料性附录）番鸭呼肠孤病毒 S1 基因序列 毒株名称：番鸭呼肠孤病毒法国 89026 株 GenBank 基因登入号：AJ278102 长度：1324 bp 1 gctttttctc ccacgatggc gcgtgccgtg tacgacttct tctctacgcc tttcgggaat 61 cgtggtctag cgactaatcg tattcaactg tcgtcactac tgtcaagttc gaattcgcca 121 tggcaacgct ttttgtctgc tttaactccg ctgactgctc caggcactgt ttcaacacct 181 gaggcacctt atccgggctc atcgttatac caggagtcca tgcttcacag cgctactatc 241 cctgggatct taggtaatcg agacgcgtgg cgcaatctca acgtcttcgg cttttcatgg 301 acagatgaag gtctctctgg acttgtcacc gcgcaggatc ctcctccagc tccaccatac 361 caaccagttt cgggacagtg gtccgacctg ctccagtatc ctcgatgggc taatcgtcaa 421 cgcgagctac agtccaaata tcccatcctt ctaagatcca ctttgctttc agctatgcgc 481 gctggcccgg tattgtacgt tgaaacctgg cccaacacga tttccggtcg acttgctgac 541 tggttcatgt cacagtatgg aaataacttc gttgatatgt gtgcacgatt gactcagtca 601 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胡奇林，林锋强，陈少莺等.番鸭呼肠孤病毒MW9710株S1基因的克隆和序列分析J.中国预防兽医学报，2004,26(1):22一25.4 胡奇林,林锋强,陈少莺等应用RT-PCR技术检测番鸭呼肠孤病毒J.中国兽医学报,2004,24(3):231-232 5 林锋强，陈仕龙，胡奇林等.番鸭呼肠孤病毒弱毒株在免疫番鸭体内的分布及排毒规律J.中国兽医学报,2008,28(11):1259-1261.6 林锋强，高春亮，陈少莺等.番鸭呼肠孤病毒和 H9 亚型禽流感病毒共感染对番鸭胸腺免疫抑制作用J.微生物学报,2011,51(10):1407-1412.7 林锋强，朱小丽，陈少莺等.番鸭呼肠孤病毒在番鸭体内的动态分布和排毒规律J.福建农业学报,2011,26(3):335-337.DB35/T 13272013 福建省地方标准 番鸭呼肠孤病毒 RT-PCR检测方法 DB35/T 13272013*2013年 7月第一版 2013年 7月第一次印刷