弓形虫聚合酶链式反应（PCR）检测方法DB22／T 1745-2012.pdf

ICS 11.220 B 41 备案号：36036-2013 DB22 吉林省 地方标准 DB 22/T 1745 2012 弓形虫聚合酶链式反应（PCR）检测方法 Detection method of polymerase chain reaction of Toxoplasma gondii 2012-12-21发布 2013-01-01实施 吉林省质量技术监督局 发布 DB22/T 1745-2012 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009给出的规则起草 本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。本标准起草单位：吉林省畜牧兽医科学研究院。本标准主要起草人：姚新华、苑淑贤、任科研、曹利利、杨金生、程荣华。DB22/T 1745-2012 1 弓形虫聚合酶链式反应（PCR）检测方法 1 范围 本标准规定了聚合酶链式反应（PCR）检测弓形虫的原理、实验材料、仪器设备、试剂、操作程序、结果判定及废弃物处理和防止 污染 的 措施。本标准 适用于 PCR法 检测弓形虫。2 规范性引用文件 下列文件对于 本 文件 的应 用是必不可少 的。凡是注日期 的 引用文件，仅所注日期 的 版 本 适用于 本 文 件。凡是不注日期 的 引用文件，其最 新 版 本（包括所有 的 修改 单）适用于 本 文件。GB/T 6682-1992 分析 实验 室用水 规 格 和试验 方法。3 原理 PCR技术是在模板 DNA、引 物和 4种脱氧核糖核酸存在 的 条件下，依赖于 DNA聚合酶的酶 促 合 成 反应，通过变性、退火、延伸周期性 的 多次循环，使两个引 物 之间 的 特异性 DNA片段得到体外扩增。出 现 1080bp电泳条带为阳性，其它为阴性。4 实验材料 4.1 眼 科 剪。4.2 眼 科 镊。4.3 称量纸。4.4 一 次性注 射 器 10 mL。4.5 无菌离心 管 1.5 mL。4.6 薄壁 PCR管 0.2 mL。4.7 琼脂 糖。4.8 量筒 500 mL。4.9 锥 形 瓶 500 mL。4.10 吸头（10 L、200 L、1000 L）。4.11 灭菌双蒸 水。5 仪器设备 5.1 分析 天平。5.2 PCR扩增 仪。5.3 台 式 低温高速离心机。DB22/T 1745-2012 2 5.4 电泳 槽。5.5 核酸电泳 仪。5.6 紫 外 凝胶 成 像 仪 或凝胶 成 像系统。5.7 可 调移液 器（2 L、20 L、200 L、1000 L）。5.8 恒温 水 浴锅。6 试剂 6.1 本标准 所用 试剂 均 为分析 纯。6.2 无菌双蒸 水 符 合 GB/T 6682-1992。6.3 溴化乙锭（EB）溶液 10 mg/mL：参见附录 A.1。6.4 电泳 缓冲液 50 TAE：参见附录 A.2。6.5 1.5%琼脂 糖 凝胶：参见附录 A.3。6.6 上样缓冲液：参见附录 A.4。6.7 10 PCR 缓冲液：参见附录 A.5。6.8 Taq DNA聚合酶 2 u/L。6.9 dNTPs 2.5 mmol/L。6.10 标准 分 子量 DL2000 DNA Marker。6.11 引 物 与 PCR扩增 结果：参见附录 B1。7 操作程序 7.1 样品处理 7.1.1 组织样品处理 取病死动 物 肝、脾、肺、淋巴 结 等组织 10 g，磨碎后加 生理 盐 水 10 mL 20 mL制 成 乳 剂，过 滤，将滤液 3 000 r/min，离心 10 min，弃 去上清液，取沉淀 物 加 生理 盐 水 悬浮后，3 000 r/min，离心 10 min，取沉淀加入等 体 积 虫 体 消化液（0.1 mol/L pH值 8.0 Tris-HCl，1%SDS，0.1 mol/L NaCl，10 mol/L EDTA）和 蛋白 酶 K（20 mol/L），混 匀 后 置 于 液 氮 5 min，65 水 浴 5 min，重复 3 次 操作 后，65 水 浴 2 h，备 用。7.1.2 腹水样品处理 取 患 病或病死动 物的 腹 水 3.0 mL，加入等 体 积 虫 体 消化液（0.1 mol/L pH值 8.0 Tris-HCl，1%SDS，0.1 mol/L NaCl，10 mol/L EDTA）和 蛋白 酶 K（20 mol/L），混 匀 后 置 于 液 氮 5 min，65 水 浴 5 min，重复 3次 操作 后，65 水 浴 2 h，备 用。7.1.3 阳性对照处理 将 虫 体（RH株）用 消化液（0.1 mol/L pH值 8.0 Tris-HCl，1%SDS，0.1 mol/L NaCl，10 mol/L EDTA）置 于 65 水 浴锅 内裂解 2 h，10000 r/min离心 5 mim，吸上清，与等 体 积 苯酚:氯仿:异 戊醇(25:24:1)混 匀，5 000 r/min离心 10 min，取上清液，加等 体 积 苯酚:氯仿:异 戊醇(25:24:1)抽 提 一 次，颠倒 混 匀 多次，常温 作 用 5 min，5000 r/min离心 10 min，吸上清，加 2倍 体 积无 水 乙 醇，0.1倍 体 积 3 mol/L NaAC于-20 放置 30 min，10000 r/min离心 10 min，取沉淀 物 加入无 水 乙 醇 700 L，7000 r/min离心 5 min，弃 上清，自 然干燥 30min-50min，用 20 L双蒸 馏 水 溶 解，-20 保 存。DB22/T 1745-2012 3 7.1.4 阴性对照处理 用 健康猪血 清 DNA作 为 标准 阴性对 照 PCR模板。7.2 PCR扩增 备检 样 品 PCR为 50 L体 系：10 PCR 缓冲液 5.0 ml 见附录 A.5 dNTPs 4.0 L Taq DNA聚合酶 1.0 L 上 游 引 物 2.0 L 见附录 B.1 下 游 引 物 2.0 L 见附录 B.2 备检 样 品 10.0 L 灭菌双 馏 水 加 至 50.0 L。同时 设 立 标准 阳性、阴性、空 白（水）样 品 对 照 样 品 组，反应 体 系与 备检 样 品 组 完全相同。PCR扩增条件为：94 预 变性 5 min；94 变性 30 s，55 复 性 30 s，72 延伸 30 s，35个循环；72 延伸 7 min；4 保持 10 min。待 检 样 品 不 能 及 时 电泳 时，-20 保 存。7.3 电泳 7.3.1 制 备 1.0%琼脂 糖 凝胶 板（见附录 A.3）。7.3.2 取 8 L PCR产 物，与 2 L上样缓冲液混 合，加入琼脂 糖 凝胶 板 的 加样 孔中。7.3.3 同 法 加入 阳性对 照 PCR产 物。7.3.4 同 法 加入 阴性对 照 PCR产 物。7.3.5 同 法 加入 空 白 对 照 PCR产 物。7.3.6 加入 标准 分 子量 DL2000 DNA Marker。7.3.7 5V/cm电 压，电泳 30 min。7.3.8 用 紫 外 凝胶 成 像 仪 或凝胶 成 像系统 观察 结果。8 结果判定 当 阳性对 照出 现 1080 bp扩增带，阴性对 照和 空 白 对 照 未 出 现 目 的 带 时，实验结果 成 立：被 检 样 品出 现 1080 bp扩增带 判 为 弓形虫 阳性，未 出 现 相 应 扩增带 样 品 判 为阴性。9 废弃物处理和防止污染的措施 9.1 检测 过 程 中 的废弃物，应 收集 后高 压 灭菌 处理。9.2 检测 过 程 中 防止 交叉 污染 的 有 效 措施是 根据 条件 划 分 出 核酸 提 取 区、基因 扩增 区 和 电泳 区。各区所有 的试剂、器材（尤 其是 移液 器）、仪器 都 应 专 用，不得带 出 该区。9.3 实验 前 后，实验 室用 紫 外 线 消 毒以破坏残留 的 DNA。电泳 后，琼脂 糖 凝胶 及 其它 被 溴化乙锭（EB）污染 的物 品 要 有 专 用 收集 处，并 进行焚烧 处理。DB22/T 1745-2012 4 A A 附 录 A（规范性附录）相关试剂配制 A.1 溴化乙锭（EB）溶液 溴化乙锭 0.2 g 无菌蒸 馏 水 加 至 20.0 mL A.2 电泳 缓冲液 制备 A.2.1 0.5 mol/L 乙二铵四乙酸二钠溶液 配制（pH8.0）。无 水 乙 二铵四 乙 酸 二钠 18.6g 无菌蒸 馏 水 80.0 mL 氢 氧 化 钠（1 mol/L NaOH）调 pH值 至 8.0 无菌蒸 馏 水 加 至 100mL A.2.2 50 TAE电泳 缓冲液 配制 三羟甲基 氨 基甲 烷（Tris）242.0 g 冰 乙 酸 57.1 mL 0.5mol/L 乙 二铵四 乙 酸 二钠 溶液（pH值 8.0）100.0 mL 无菌蒸 馏 水 加 至 1 000 mL 作 电泳 液 使用 时，用 无菌蒸 馏 水 50倍 稀释。A.3 1.0%琼脂糖凝胶板 制备 琼脂 糖 1.0 g 50 TAE 电泳 缓冲液 2.0 mL 无菌蒸 馏 水 98.0 mL 微波炉 中完全 融 化，待 冷却 至 5060时，加溴化乙锭（EB）溶液 5 L，摇 匀，倒 入 电泳板 上，凝 固 后取 下 梳 子，备 用。A.4 上 样 缓冲液 溴 酚 蓝 0.2 g，加 10 mL无菌蒸 馏 水过 夜 溶 解。50 g蔗 糖 加入 50 mL无菌蒸 馏 水 溶 解 后，移入 已 溶 解 的 溴 酚 蓝 溶液 中，摇 匀 定 容 至 100 mL。A.5 10 PCR扩增 缓冲液 DB22/T 1745-2012 5 1 mol/L Tris-HCl（pH值 8.8）10.0 mL 1 mol/L KC1 50.0mL Nonidet P40 8.0 mL 1.5 mol/L MgCl2 1.0 mL 无菌蒸 馏 水 加 至 100 mL DB22/T 1745-2012 6 B B 附 录 B（规范性附录）引物 B.1 上游 引物 P1：5-AAT AAG CTT ATG CGA GGC GGG ACG TCC-3 B.2 下游 引物 P2：5-ATA GCT GAC TCA CTG CTT AAT TTT CTC-3 B.3 引物 浓度 引 物 浓度 均 为 15 pmol/L。B.4 标准阳性 PCR扩增结果 扩增 结果 见 图 B1。图 B.1 扩增结果 _ 1080bp 1:标准 分 子量 DL2000 DNA Marker 2:MIC3 基因 片段 1 2