海水养殖鱼类刺激隐核虫病诊断规程DB35／T 1353-2013.pdf

ICS 65.150 B 51 DB35 福 建 省 地 方 标 准 DB35/T 13532013 海水养殖鱼类刺激隐核虫病诊断规程 Diagnostic protocols for Cryptocaryonosis of marine cultured fish 2013-08-01发布 2013-11-01实施 福建省质量技术监督局 发 布 DB35/T 13532013 I 前 言 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准按照GB/T 1.1-2009标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写给出的规则编写。本标准由福建省海洋与渔业厅提出并归口。本标准负责起草单位：福建省淡水水产研究所、福建省水生动物疫病预防控制中心。本标准主要起草人：樊海平、卓玉琛、林煜、吴斌、马平、曾占壮、钟全福、翁祖桐。DB35/T 13532013 1 海水养殖鱼类刺激隐核虫病诊断规程 1 范围 本标准规定了海水养殖鱼类刺激隐核虫病的术语与定义、流行情况与主要症状、样品采集与处理、形态学及PCR诊断。本标准适用于海水养殖鱼类刺激隐核虫病的诊断、流行病学调查、检疫与监测。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 SC/T 7014-2006 水生动物检疫实验技术规范 SC/T 7103-2008 水生动物产地检疫采样技术规范 SC/T 7202.2-2007 斑节对虾杆状病毒病诊断规程 第2部分：PCR检测法 3 术语与定义 下列术语与定义适用于本文件。3.1 刺激隐核虫病 Cryptocaryonosis 俗称海水小瓜虫病，海水养殖鱼类受刺激隐核虫（Cryptocaryon irritans）感染，发生病理变化，出现行为异常或死亡。4 试剂与仪器 4.1 试剂与溶液 4.1.1 水：GB/T 6682，一级。4.1.2 海水：压力为1.05 kg/cm2，121.3 高压蒸汽灭菌15 min。4.1.3 生理盐水。4.1.4 固定液：4甲醛或70乙醇。4.1.5 引物：F1：5-GTTCCCCTTGAACGAGGAATTC-3，浓度10 mol/L，-20 保存；R1：5-TGAGAGAATTAATCATAATTTATAT-3，浓度10 mol/L，-20 保存。4.1.6 溶菌酶（100 g/mL）：生化试剂，-20 保存。DB35/T 13532013 2 4.1.7 蛋白酶K（100 g/mL）、NaCl（3 mol/L）、裂解缓冲液、SYBR Green工作液按附录A的规定配制。4.1.8 DNA分子量标准（0.1 kb1.5 kb）：生化试剂，-20 保存。4.1.9 阳性对照：刺激隐核虫DNA 模板，-20 保存。4.1.10 阴性对照：未感染刺激隐核虫的海水鱼类DNA模板，-20 保存。4.1.11 空白对照：无菌双蒸水为模板。4.1.12 Giemsa染色液：Giemsa干粉1 g，甘油（分析纯）66 mL，甲醇（分析纯）66 mL。将Giemsa干粉倒入研钵内，加少量甘油，研磨至无颗粒状，将剩余甘油倒入研钵内磨匀，然后装入棕色试瓶中，56 温箱中保温2 h，再加入甲醇混匀后贮存备用。4.1.13 甘油（分析纯）。4.1.14 除上述试剂与溶液外，其余按SC/T 7202.2-2007第 5 章的规定执行。4.2 仪器与设备 4.2.1 光学显微镜、解剖镜和放大镜（30）。4.2.2 PCR扩增仪：配备25 L和50 L的PCR反应底座。4.2.3 凝胶成像仪：可发射紫外线，携带摄影系统。4.2.4 电泳仪：输出直流电压0 V400 V，直流电流1 mA500 mA。4.2.5 水平电泳槽：容量250 mL650 mL，带凝胶板、样孔梳。4.2.6 台式离心机：配备1.5 mL转子，转速16 000 r/min以上。4.2.7 电动研磨器：转速500 r/min5 000 r/min。4.2.8 研磨棒：1.05 kg/cm2、121.3 高压蒸汽灭菌15 min。4.2.9 离心管：1.5 mL，1.05 kg/cm2、121.3 高压蒸汽灭菌15 min。4.2.10 PCR反应管：25 L和50 L，1.05 kg/cm2、121.3 高压蒸汽灭菌15 min。4.2.11 铜网：孔径500 m（32目）。4.2.12 超声波细胞破碎仪：工作频率0 KHz60 KHz。4.2.13 除上述仪器与设备外，其余按SC/T 7202.2-2007第 6 章的规定执行。5 流行情况与主要症状 5.1 流行情况 几乎在所有海水养殖鱼类中都可发生，主要危害大黄鱼、卵形鲳鯵、石斑鱼、真鲷、斜带髭鲷和鮸鱼等，对苗种造成的危害大于成鱼。水温10 30 均可发生，发病时间主要为5 月下旬7月中旬（水温约为22 28）和 9月中旬11月下旬（水温约为25 19）两季。5.2 主要症状 病鱼游动迟缓，对外界刺激反应迟钝，呼吸困难，摄食量减少；病情严重时，病鱼离群于水面缓慢游动，不摄食。体表、眼角膜、口腔周围和鳃可观察到白点，体表、鳍、鳃黏液增生形成白色混浊状薄膜，病情严重时体表出现点状出血。6 样品采集与处理 6.1 采样 DB35/T 13532013 3 从同一个养殖网箱或池塘中采集具有临床症状的鱼体，全长小于5 cm的为10尾，全长大于或等于5 cm的为5尾，其余按SC/T 7014-2006第6章的规定执行。6.2 样品封存、运输、登记与保存 按SC/T 7103-2008第9章、第10章、第11章和12章的规定执行。7 形态学诊断 7.1 显微镜检查 刮取不小于2 cm2的体表黏液、剪取0.5 cm2以上的尾鳍和左右鳃的第2鳃瓣的鳃丝，分别置于洁净载玻片上，加适量海水，制作水封片，在1010的低倍镜下观察到卵圆形、大小为（0.066 mm 0.45 mm）（0.034 mm0.36 mm），全身纤毛做旋转运动的虫体，有时可见虫体内含“U”形大核。7.2 病原体确认 刮取体表或鳃的白点，于装有海水的培养皿中静置，在解剖镜或放大镜下吸取虫体，用4甲醛或70乙醇固定过夜，吸取虫体涂于载玻片，常温干燥后，Giemsa染液染色30 s，2倍3倍双蒸水浸洗2 min，再水洗，常温干燥，甘油封片，显微镜观察虫体形态，参照附录B确认。7.3 诊断 检测样品主要症状与5.2描述相符，病原体确认虫体为刺激隐核虫，其中有一个样片在一个视野中观察到不少于3个虫体，即可诊断患刺激隐核虫病。8 PCR诊断 8.1 样品准备 全长小于 5 cm 的鱼体，采集后立刻放入 70乙醇固定过夜后，将固定的样品剪碎，电动研磨器 5 000 r/min研磨10 min至匀浆状，加生理盐水于500 m 的铜网中过滤，滤液10 000 r/min离心5 min，取沉淀物备用。8.2 DNA的提取 取50 mg沉淀物，加180 L裂解缓冲液溶解后，加20 L蛋白酶K混匀，55 裂解2 h，其间用电动研磨器5 000 r/min研磨5 min或超声波破碎样品40 KHz破碎10 s；裂解样品16 000 r/min离心10 min，取上清液于1.5 mL离心管中；加等体积的酚-氯仿-异戊醇混合液，颠倒混匀8 min，16 000 r/min离心10 min，取上层液体于1.5 mL离心管中；加1/10体积的3 mol/L NaCl，2.5体积的无水乙醇，颠倒混匀 5 min，-20 放置30 min，16 000 r/min离心10 min，弃上清液；加70乙醇500 L重悬沉淀，16 000 r/min离心5 min，弃上清液；室温下干燥10 min；加TE缓冲液30 L，-20 保存备用。8.3 PCR扩增 8.3.1 反应体系的准备 PCR反应可选择25 L或50 L反应体系进行。按表1的要求，加入除Taq酶以外的各项试剂，配制成无酶反应预混物。按检测PCR反应体系1份/支或100份/支分装，-20 保存。临用前，根据所需的反应DB35/T 13532013 4 份数，取出无酶反应预混物，加入相应体积的Taq酶和待测样品模板混匀，按1份/支分装到0.2 mL PCR管中。表1 PCR反应所需试剂组成 试 剂 25 L反应体系 50 L反应体系 试剂终浓度 10PCR 缓冲液 2.5 L 5.0 L 1 氯化镁（25 mmol/L）3.0 L 6.0 L 3 mmol/L dNTP（10 mmol/L）1.0 L 2.0 L 200 mol/L 引物 F1（10 mol/L）0.5 L 1.0 L 0.08 mol/L 引物 R1（10 mol/L）0.5 L 1.0 L 0.08 mol/L 灭菌双蒸水 16.4 L 32.8 L TaqDNA 聚合酶（5 U/L）0.1 L 0.2 L 0.02 U/L 1 份反应总体积 25.0 L 50.0 L 100 份反应总体积 250.0 L 500.0 L 注：每25.0 L体系模板量1.0 L；每50.0 L体系模板量2.0 L。8.3.2 扩增程序 8.3.2.1 按照表1各反应体系所需的模板体积要求，在含有反应物的PCR管中分别加入相应体积的各样品DNA模板。并设阳性对照、阴性对照和空白对照。每个样品制备3个平行样。8.3.2.2 将含有反应物的PCR管置于PCR仪反应槽中，按以下程序扩增：94 预变性5 min，（94 变性30 s，54 退火30 s，72 延伸1.5 min）35个循环，72 延伸5 min，4 保存备用。8.4 琼脂糖凝胶的制作 8.4.1 用1电泳缓冲液配制1的琼脂糖凝胶，加热至溶液完全透明。8.4.2 将凝胶液缓缓倒入放置好样孔梳的凝胶板，胶液厚度0.6 cm0.8 cm，样孔梳底部水平深入凝胶层0.3 cm0.5 cm，距凝胶底部0.2 cm。8.5 电泳 8.5.1 将已制备好的琼脂糖凝胶放入水平电泳槽，加样孔朝负极，加1电泳缓冲液没过胶面0.1 cm0.2 cm。8.5.2 10 L PCR扩增产物加入1.3 L SYBR Green工作液和2 L 6载样缓冲液混匀，室温放置10 min后加到加样孔中。同时设一个泳道加入5 L DNA分子量标准物。8.5.3 盖上电泳槽后通电，在1 V/cm5 V/cm下电泳30 min，当载样缓冲液中的溴酚蓝指示剂的色带迁移至琼脂糖凝胶的1/22/3处时停止电泳，将凝胶置于凝胶成像仪上观察与拍照。8.6 分子量计算 按 SC/T 7202.2-2007中7.1.7的规定执行。DB35/T 13532013 5 8.7 PCR结果判定 8.7.1 检测样品和阳性对照在 541 bp处有一条特定条带出现，阴性和空白对照无特定条带出现（参见附录C），判定检测样品为阳性。8.7.2 阳性对照在541 bp处有一条特定条带出现，检测样品、阴性对照和空白对照无特异条带出现（参见附录C），判定检测样品为阴性。8.8 诊断 8.8.1 检测样品主要症状与5.2描述相符，PCR检测结果为阳性，诊断为患刺激隐核虫病。8.8.2 检测样品主要症状与5.2描述不符，PCR检测结果为阳性，诊断为携带刺激隐核虫。8.8.3 PCR检测结果为阴性，诊断为非刺激隐核虫病。DB35/T 13532013 6 A A 附 录 A（规范性附录）试剂配制 A.1 10 mg/mL蛋白酶K 蛋白酶K 10 mg 水 1 mL 溶解后0.22 m过滤除菌，分装于无菌离心管中（0.2 mL/管），-20 保存。A.2 100 g/mL蛋白酶K 10 mg/mL蛋白酶K 100 L 水 10 mL 溶解后分装于无菌离心管中（0.5 mL/管），-20 保存。A.3 3 mol/L NaCl 氯化钠（NaCl）17.5 g 水 50 mL 磁力搅拌至完全溶解，加水定容至100 mL，1.05 kg/cm2，121.3 高压蒸汽灭菌15 min，室温贮存。A.4 裂解缓冲液 1 mol/L Tris-HCl（pH 8.0）10 mL 0.5mol/L EDTA（pH 8.0）2 mL 10 SDS 10 mL 3 mol/L NaCl 3 mL 加水定容至 100 mL 混匀，室温贮存。A.5 SYBR Green工作液 SYBR Green 10 L 1电泳缓冲液 990 L 混匀，2 8 保存，一个月内使用。DB35/T 13532013 7 B B 附 录 B（资料性附录）刺激隐核虫（Cryptocaryon irritans）的形态与生活史 B.1 形态 刺激隐核虫的滋养体呈球形或卵形，个体大小为（0.066 mm0.45 mm）（0.034 mm0.36 mm）。全身被有纤毛，前端有一胞口。有4个8个（一般4个）卵圆形的核质，相连呈念珠状，作“U”形排列成大核。显微镜下虫体的表膜较厚，虫体细胞质较浓密，内有许多颗粒，透明度低，大核一般不易看清。B.2 生活史 刺激隐核虫发育为4个阶段：营养期(feeding stage)、休眠期(resting stage)、分裂期(dividing stage)和感染期(infecting stage)。鱼体皮肤和鳃皮层中生长发育的是滋养体(trophont),滋养体成熟后从鱼体脱落到水中自由游动一短暂时期，后附着在固着物上，形成包囊(tomont)，即进入休眠期。水温等环境适合时，包囊内的原生质细胞经历一系列分裂(分裂期)，形成幼体(tomite)。幼体成熟后逸出包囊进入水中，即为具有感染能力的幼虫(theront)，幼虫一旦遇到宿主，即侵入皮肤和鳃，发育成滋养体。a）滋养体 b)包囊 c)包囊中幼虫 d)逸出幼虫 图B.1 刺激隐核虫发育各阶段形态与患刺激隐核虫病的大黄鱼 DB35/T 13532013 8 e）患刺激隐核虫病的大黄鱼 图B.1 刺激隐核虫发育各阶段形态与患刺激隐核虫病的大黄鱼（续）说明：1宿主鱼；2滋养体；3包囊初期，细胞质内出现许多液泡，大核膨大，小核明显；4大核盘曲，小核多个，包囊壁分3层，中层波状；5分裂成大小两个细胞；6小细胞继续分裂；7分裂成许多纤毛幼虫；8自包囊出来的纤毛幼虫感染鱼体 注：37所示为包囊期。图B.2 刺激隐核虫生活史（仿孟庆显）DB35/T 13532013 9 C C 附 录 C（资料性附录）刺激隐核虫PCR检测电泳图 说明：1DNA Marker；2空白对照；3阴性对照；4阳性对照；5阳性样品。图C.1 刺激隐核虫PCR检测电泳图 _ DB35/T 13532013 福 建 省 地 方 标 准 海水养殖鱼类刺激隐核虫病诊断规程 DB35/T 13532013*2013 年 9 月第一版 2013年 9 月第一次印刷