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I C S 6 7.1 2 0.1 0C C S X 2 2DB36江 西 省 地 方 标 准D B 3 6/T 1 8 8 1 2 0 2 3黑 斑 侧 褶 蛙 米 尔 伊 丽 莎 白 菌 分 离 鉴 定 技 术规 范T e c h n i c a l s p e c i f i c a t i o n f o r i s o l a t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n o f E l i z a b e t h k i n g i a m i r i c o l a i nR a n a n i g r o m a c u l a t a2 0 2 3-1 1-2 0 发 布 2 0 2 4-0 5-0 1 实 施江 西 省 市 场 监 督 管 理 局发 布D B 3 6/T 1 8 8 1 2 0 2 3I目 次前 言.I I1 范 围.12 规 范 性 引 用 文 件.13 术 语 与 定 义.14 设 备 和 材 料.15 培 养 基 和 试 剂 配 制.26 分 离 与 鉴 定 技 术 流 程.27 操 作 步 骤.28 回 归 感 染.49 菌 种 保 存 及 生 物 安 全.4附 录 A（资 料 性 附 录）设 备 和 材 料.5附 录 B（资 料 性 附 录）培 养 基 和 试 剂 配 制.6D B 3 6/T 1 8 8 1 2 0 2 3I I前 言本 文 件 按 照 G B/T 1.1 2 0 2 0 标 准 化 工 作 导 则 第 1 部 分:标 准 化 文 件 的 结 构 和 起 草 规 则 的 规 定 起 草。本 文 件 的 某 些 内 容 有 可 能 涉 及 专 利。本 文 件 的 发 布 机 构 不 承 担 识 别 这 些 专 利 的 责 任。本 文 件 由 江 西 省 农 业 农 村 厅 提 出 并 归 口。本 文 件 起 草 单 位：江 西 省 农 业 科 学 院 畜 牧 兽 医 研 究 所、南 昌 大 学、江 西 省 农 业 技 术 推 广 中 心。本 文 件 主 要 起 草 人：刘 文 舒、郭 小 泽、王 玉 柱、李 思 明、简 少 卿、李 小 勇、陈 彦 良、唐 艳 强、肖 海红。D B 3 6/T 1 8 8 1 2 0 2 31黑 斑 侧 褶 蛙 米 尔 伊 丽 莎 白 菌 分 离 鉴 定 技 术 规 范1 范 围本 文 件 规 定 了 黑 斑 侧 褶 蛙 米 尔 伊 丽 莎 白 菌 分 离 鉴 定 的 设 备 和 材 料、培 养 基 和 试 剂 配 制、分 离 与 鉴 定技 术 流 程、操 作 步 骤、回 归 感 染 和 菌 种 保 存 及 生 物 安 全。本 文 件 适 用 于 黑 斑 侧 褶 蛙 米 尔 伊 丽 莎 白 菌 分 离 鉴 定，其 他 蛙 类 米 尔 伊 丽 莎 白 菌 分 离 鉴 定 可 参 考 实施。2 规 范 性 引 用 文 件下 列 文 件 中 的 内 容 通 过 文 中 的 规 范 性 引 用 而 构 成 本 文 件 必 不 可 少 的 条 款。其 中，注 日 期 的 引 用 文件，仅 该 日 期 对 应 的 版 本 适 用 于 本 文 件；不 注 日 期 的 引 用 文 件，其 最 新 版 本(包 括 所 有 的 修 改 单)适 用 于本 文 件。G B/T 6 6 8 2 分 析 实 验 室 用 水 规 格 和 试 验 方 法G B/T 1 9 4 8 9 实 验 室 生 物 安 全 通 用 要 求动 物 病 原 微 生 物 菌（毒）种 保 藏 管 理 办 法（2 0 2 2 年 1 月 7 日 农 业 农 村 部 令 2 0 2 2 年 第 1 号 修 订）3 术 语 与 定 义下 列 术 语 与 定 义 适 用 于 本 文 件。3.1双 毁 髓 法 D o u b l e p i t h i n g毁 髓 针 刺 入 蛙 枕 骨 大 孔 后，将 针 后 端 压 平，水 平 向 前 进 入 蛙 颅 腔，左 右 摆 动，捣 毁 双 侧 脑 组 织。将针 抽 出 至 枕 骨 大 孔 处，水 平 向 后 进 入 脊 椎 管，前 后 滑 动 捣 毁 脊 髓。3.2聚 合 酶 链 式 反 应 P o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n,P C R在 体 外 酶 促 合 成 特 异 D N A 片 段 的 一 种 方 法，是 由 高 温 变 性、低 温 退 火 和 中 温 延 伸 反 应 组 成 1 个 周 期，循 环 进 行，使 目 的 D N A 得 以 快 速 进 行 扩 增。3.3基 因 测 序 G e n e s e q u e n c i n g基 因 测 序 是 对 基 因 序 列 上 的 碱 基 排 列 进 行 解 析 的 过 程。3.4回 归 感 染 R e c u r r e n t i n f e c t i o nD B 3 6/T 1 8 8 1 2 0 2 32实 验 室 中 通 过 人 工 手 段，将 某 些 分 离 得 到 的 病 原 体（如 细 菌、病 毒 等）重 新 注 入 动 物 体 内，观 察 动物 发 病 情 况。4 设 备 和 材 料设 备 和 材 料 见 附 录 A。5 培 养 基 和 试 剂 配 制培 养 基 和 试 剂 配 制 见 附 录 B。实 验 室 用 水 规 格 和 试 验 方 法 参 照 G B/T 6 6 8 2 执 行。6 分 离 与 鉴 定 技 术 流 程图 1 黑 斑 侧 褶 蛙 米 尔 伊 丽 莎 白 菌 分 离 鉴 定 技 术 流 程D B 3 6/T 1 8 8 1 2 0 2 337 操 作 步 骤7.1 采 样7.1.1 病 蛙 采 集 回 实 验 室 后，用 清 水 清 洗 蛙 体。7.1.2 对 病 蛙 进 行 双 毁 髓 法 操 作。7.1.3 待 病 蛙 完 全 进 入 死 亡 状 态 后，用 酒 精 棉 球（7 5%酒 精）对 病 蛙 体 表 和 眼 部 消 毒。7.1.4 将 杀 菌 消 毒 后 的 病 蛙 置 于 无 菌 操 作 台 内 的 托 盘 上，用 镊 子 和 手 术 剪 刀 进 行 解 剖，取 出 眼 部、脑部、肝、脾、肾 组 织。7.2 病 菌 的 培 养7.2.1 在 无 菌 状 态 下 将 所 采 组 织 进 行 剪 碎 或 匀 浆。7.2.2 将 剪 碎 或 匀 浆 后 的 组 织 液 与 营 养 肉 汤 按 照 1:1 0 比 例 进 行 混 合，恒 温 培 养 箱（2 8 1）振 荡（1 8 0 r/m i n）培 养 2 4 h。7.2.3 将 培 养 好 的 菌 悬 浊 液 摇 晃 均 匀，在 无 菌 状 态 下 划 线 接 种 于 营 养 琼 脂 中，恒 温 培 养 箱（2 8 1）培 养 2 4 h，观 察。7.2.4 选 取 优 势 菌 落 接 种 于 新 的 营 养 琼 脂，恒 温 培 养 箱（2 8 1）培 养 2 4 h，待 进 一 步 鉴 定。7.3 病 菌 样 品 的 鉴 定7.3.1 形 态 学 鉴 定菌 落 颜 色 为 米 色 或 淡 黄 色，边 缘 整 齐，半 透 明，表 面 湿 润、光 滑。7.3.2 分 子 生 物 学 鉴 定7.3.2.1 P C R 模 板 的 制 备接 种 环 挑 选 培 养 基 上 待 检 菌 落，置 于 0.5 m L 灭 菌 生 理 盐 水 中，4 0 0 0 r/m i n 离 心 2 m i n，弃 上 清；再 加0.5 m L 无 菌 水 重 悬 并 涡 旋 混 匀，1 0 0 沸 水 中 煮 沸 1 0 m i n 后，移 至 冰 面 上，冷 却 后 4 0 0 0 r/m i n 离 心 3 0 s，取 上 清 液 作 为 P C R 模 板 待 用。7.3.2.2 P C R 反 应 体 系 的 配 制按 照 1 0 P C R b u f f e r 2 L，d N T P m i x 2 L，上 下 游 引 物 各 0.5 L（1 0 m o l/L），T a q 酶(2.5 U/L)0.2 L，菌 液 2 L，d d H 2 O 1 2.8 L 配 制 2 0 L P C R 反 应 体 系。7.3.2.3 P C R 反 应 条 件1 6 S r D N A 扩 增 条 件：9 5 预 变 性 5 m i n，9 4 变 性 3 0 s，5 5 退 火 3 0 s，7 2 延 伸 9 0 s，共 3 2 个 循环，最 后 7 2 延 伸 1 0 m i n。g y r B 基 因 扩 增 条 件：9 5 预 变 性 5 m i n，9 4 变 性 3 0 s，5 5 退 火 3 0 s，7 2 延 伸 3 0 s，共 3 2 个 循环，最 后 7 2 延 伸 1 0 m i n。7.3.2.4 电 泳 及 成 像 观 察取 5 L P C R 扩 增 产 物 和 1 L 上 样 缓 冲 液，混 匀 后 加 入 1.2%琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 加 样 孔 中，同 时 在 空 白孔 加 入 5 L M a r k e r 标 准 品。电 泳 结 束 后，取 出 凝 胶 板 置 于 紫 外 投 射 仪 上，打 开 紫 外 灯 观 察 或 用 凝 胶 成像 仪 进 行 成 像 观 察，确 定 P C R 效 果。D B 3 6/T 1 8 8 1 2 0 2 347.3.2.5 基 因 测 序将 扩 增 产 物 进 行 基 因 测 序，在 N C B I（h t t p s:/w w w.n c b i.n l m.n i h.g o v/）比 对，与 已 有 基 因 同 源 性 高 于9 8%即 可 确 定 为 米 尔 伊 丽 莎 白 菌。8 回 归 感 染将 分 离 的 米 尔 伊 丽 莎 白 菌 在 营 养 肉 汤 中 振 荡 培 养 2 4 h，4 0 0 0 r/m i n 离 心 1 0 m i n 沉 淀 菌 体，去 上 清 后 用无 菌 p H 7.2 的 无 菌 磷 酸 缓 冲 液（1 P B S）稀 释 成 浓 度 为 1 1 06、1 1 07、1 1 08c f u/m L。每 个 稀 释 梯 度 通 过腹 腔 注 射 到 健 康 蛙（0.2 m L/只），用 1 P B S 缓 冲 液 作 对 照。常 规 管 理 1 5 天，观 察 记 录 患 病 死 亡 情 况，从产 生 典 型 白 内 障 病 症 状 的 感 染 蛙 再 次 进 行 细 菌 分 离，经 1 6 S r D N A 和 g y r B 基 因 分 子 鉴 定，所 分 离 的 细 菌与 米 尔 伊 丽 莎 白 菌（E.m i r i c o l a）同 源 性 达 到 9 8%以 上，则 证 实 分 离 的 病 原 菌 确 定 为 黑 斑 侧 褶 蛙 白 内 障的 致 病 菌。9 菌 种 保 存 及 生 物 安 全为 了 保 护 实 验 室 人 员 的 安 全，应 由 具 备 专 业 知 识 的 人 员 进 行 检 测，所 有 培 养 物 和 废 弃 物 参 照 G B/T1 9 4 8 9 及 国 家 有 关 规 定 执 行。菌 种 应 由 具 备 专 业 相 关 资 质 的 实 验 室 根 据 动 物 病 原 微 生 物 菌（毒）种 保 藏 管 理 办 法 进 行 妥 善 保存。D B 3 6/T 1 8 8 1 2 0 2 35附 录 A（资 料 性 附 录）设 备 和 材 料A.1 设 备无 菌 工 作 台、手 持 式 均 质 器（适 用 于 1.5 m L 离 心 管）、恒 温 培 养 箱、恒 温 水 浴 锅、高 速 冷 冻 离 心机（最 大 转 速 1 2 0 0 0 r/m i n）、微 波 炉、涡 旋 仪、P C R 仪、电 泳 仪、自 动 凝 胶 成 像 系 统、电 子 天 平（最小 刻 度 0.0 1 g）、冷 藏（4）和 冷 冻（-2 0）功 能 的 冰 箱 等。A.2 材 料剪 刀、一 次 性 接 种 环、三 角 瓶、无 菌 培 养 皿（直 径 9 0 m m）、微 量 加 样 器（1 L、2.5 L、1 0 L、1 0 0 L 和 1 0 0 0 L）、T i p 头（与 微 量 加 样 器 相 匹 配）、P C R 管（0.2 m L）、1.5 m L 和 2.0 m L 无 菌 离心 管 等。D B 3 6/T 1 8 8 1 2 0 2 36附 录 B（资 料 性 附 录）培 养 基 和 试 剂 配 制B.1 营 养 肉 汤成 分：蛋 白 胨 1 0.0 g/L；酵 母 粉 5.0 g/L；氯 化 钠 1 0.0 g/L；p H 值 7.2 0.2（2 5）。制 作 方 法：将 上 述 成 分 混 合，加 入 双 蒸 水 或 去 离 子 水 中，调 整 p H 值 至 7.2 0.2，滤 清，分 装，1 2 1 灭 菌 1 5 m i n。B.2 营 养 琼 脂成 分：蛋 白 胨 1 0.0 g/L；酵 母 粉 5.0 g/L；氯 化 钠 1 0.0 g/L；琼 脂 1 5.0 g/L；p H 值 7.2 0.2（2 5）。制 作 方 法：将 上 述 成 分 混 合，加 入 双 蒸 水 或 去 离 子 水，调 整 p H 值 至 7.2 0.2，1 2 1 灭 菌 1 5 m i n，冷 却 至 5 0 左 右 时 在 无 菌 状 态 下 倾 注 适 量 液 态 培 养 基 至 细 菌 培 养 平 板 中 冷 却，备 用。B.3 1.2%琼 脂 糖 凝 胶称 取 1.2 g 琼 脂 糖，加 入 1 0 0 m L 1 T A E 缓 冲 溶 液 中，加 入 核 酸 染 料，微 波 炉 加 热 至 完 全 融 化，依 据样 品 数 选 用 适 宜 的 梳 子，将 琼 脂 糖 倒 入 凝 胶 盘 中，胶 板 厚 度 要 均 匀，0.5 c m 左 右。待 凝 胶 冷 却 后 拔 出 梳子，取 出 胶 块 放 入 电 泳 槽 中，加 入 1 T A E 缓 冲 溶 液 淹 没 胶 面。B.4 5 0 T A E 缓 冲 溶 液取 2 4 2 g T r i s 碱，5 7.1 m L 冰 乙 酸，1 0 0 m L 0.5 M E D T A（p H 8.0），加 纯 水 至 1 0 0 0 m L，备 用。B.5 1 T A E 缓 冲 溶 液将 5 0 T A E 缓 冲 溶 液 1 份 加 入 4 9 份 蒸 馏 水，混 匀，备 用。B.6 引 物 配 制将 合 成 的 1 6 S r D N A 和 g y r B 引 物 用 双 蒸 水 稀 释 成 1 0 m o l/L。1 6 S r D N A 上 游 引 物 序 列：2 7 F 5-A G A G T T T G A T C C T G G C T C A G-3，下 游 引 物 序 列：1 4 9 2 R 5-G G T T A C C T T G T T A C G A C T T-3，扩 增片 段 长 度 约 1 5 0 0 b p。g y r B 基 因 上 游 引 物 序 列：g y r B 3 F 5-T C C G G C G G T C T G C A C G G C G T-3，下 游 引 物序 列：g y r B 1 4 R 5-T T G T C C G G G T T G T A C T C G T C-3，扩 增 片 段 长 度 约 1 2 0 0 b p。B.7 其 他 试 剂（商 品 化 试 剂）灭 菌 生 理 盐 水、P B S 缓 冲 液、双 蒸 水、1 0 P C R 缓 冲 液、T a q 聚 合 酶（0.5 U/L）、d N T P s（2 m m o l/L）、D N A M a r k e r（D L 2 0 0 0）、上 样 缓 冲 液、核 酸 染 料（G e l R e d）等。_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _
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