产气荚膜梭菌分离与鉴定操作规程DB15／T 3438—2024.pdf

ICS 65.020.30 CCS B 41 15 内蒙古自治区地方标准 DB15/T 3438 2024 产气荚膜 梭 菌分离 与鉴定操 作规程 Operating procedures for isolation and identification of sheep clostridium perfringens 2024-05-31 发布 2024-07-01 实施 内蒙古自 治区市 场 监督管理 局 发 布 DB15/T 3438 2024 I 前 言 GB/T 1.1 2020 1 SAM/TC 19 DB15/T 3438 2024 1 产气荚膜 梭菌分 离与鉴定 操作规 程 1 范围 2 规范性 引用 文件 GB 4789.28 GB/T 6682 3 术语和 定义 产气荚 膜梭 菌 clostridium perfringens（C.perfringens）C.welchii A B C D E F G 4 操作步 骤 方法概 要 A 培养基 和试 剂 4.2.1 GB/T 6682 4.2.2-TSC B B.1 4.2.3 FTG B B.2 4.2.4 B B.3 4.2.5(LS)B B.4 4.2.6 Taq DNA 4.2.7 4.2.8 DB15/T 3438 2024 2 4.2.9 DL-600 DL-2000 4.2.10 TAE 10 mmol/L Tris-HCl pH 8.0 1 mmol/L EDTA pH 8.0 仪器和 设备 4.3.1 4.3.2 0 g 500 g 0.01 g 4.3.3 4.3.4 PCR 4.3.5 4.3.6 37 4.3.7 46 4.3.8 4.3.9 4.3.10 4.3.11 2 8 4.3.12 2 8 方法 4.4.1 样品采 集 10.0 g 2 3 4 24 h 4.4.2 细菌的 分离 4.4.2.1 组织样 本的 分菌 TSC 37 20 h 24 h 4.4.2.2 肛拭子、粪 便或 肠道 内容 物样本 的分 菌 20 mL 30 s 1 min 1.0 g 5.0 g 20 mL 50 mL 30 s 1 min 50 L TSC 37 20 h 24 h 4.4.3 细菌鉴 定 4.4.3.1 TSC 5 FTG 37 20 h 24 h 4.4.3.2 GB/T 4789.28 TSC FTG 37 20 h 24 h DB15/T 3438 2024 3 4.4.3.3 1 mL FTG 46 2 h 5 h 4.4.3.4 1 mL FTG LS 46 18 h 24 h LS()LS 1/4 LS 1/4 5 LS 46 18 h 24 h 4.4.4 PCR 扩增 4.4.4.1 产气荚 膜梭 菌 16S rRNA 扩 增检测 1 mL FTG 1.5 mL 12000 r/min 3 12000 r/min 10 min DNA C PCR 95 3 min 95 20 s 55 30 s 72 40 s 32 72 10 min 4 4.4.4.2 产气荚 膜梭 菌特 异性 序列 扩增检 测 DNA 4.4.4.1 D PCR 94 5 min 94 45 s 53 45 s 72 45 s 35 72 10 min 4 4.4.4.3 琼脂糖 凝胶 电泳 1%8 L PCR 2 L 80 V 25 min 4.4.4.4 电泳结 果 16S rRNA PCR 1400 bp PCR PCR 475 bp 5 结果判 定 LS 1/4 16S rRNA PCR 475 bp 6 废弃物 处理 和防 止污 染的 措施 DB15/T 3438 2024 4 DB15/T 3438 2024 5 A A 附录A（规范 性）羊产气 荚膜 梭菌 检测 A.1 图A.1 羊产 气荚 膜梭 菌检 测流 程 图 DB15/T 3438 2024 6 B B 附录B（资料 性）培养基 和试 剂 B.1 胰胨-亚硫 酸盐-环丝 氨酸（TSC）琼 脂平 板 B.1.1 基础成 分 B.1 表B.1 基础 成分 B.1.2 D-环丝 氨酸 1 g D-200 mL 0.22 m 2 8 B.1.3 制法 pH 7.6 0.2 121 15 min50 1 250 mL 20 mL D-2 8 B.2 液体硫 乙醇 酸盐 培养 基（FTG）B.2.1 成分 B.2 表B.2 成分 15.0 g 5.0 g 5.0 g 1.0 g 1.0 g 15.0 g 1000.0 mL 15.0 g L-0.5 g 5.0 g 5.0 g 2.5 g 0.5 g 0.001 g 0.75 g 1000.0 mL DB15/T 3438 2024 7 B.2.2 制法 1000 mL pH 7.1 0.2 121 15 min 2 8 B.3 含铁牛 奶培 养基 B.3.1 成分 B.3 表B.3 成分 B.3.2 制法 1000 mL 116 10 min B.4 乳糖亚 硫酸 盐培 养基(LS)B.4.1 基础成 分 B.4 表B.4 基础 成分 B.4.2 焦亚硫 酸钠(Na2S2O5)1.2 g 100 mL 0.22 m 2 8 B.4.3 柠檬酸 铁铵 1 g 100 mL 0.22 m 2 8 B.4.4 制法 pH 7.1 0.2 121 15 min 0.5 mL 8 mL 100.0 g FeSO4 7H2O 1.0 g 1000.0 mL 5.0 g 2.5g 10.0 g 2.5 g L-0.3 g 1000.0 mL DB15/T 3438 2024 8 C C 附录C（资料 性）羊产气 荚膜 梭 菌 16S rRNA 序列的 扩增 16S rRNA C.1 表C.1 用于16S rRNA 序列 扩增 的引物 27-F 5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 1492-R 5-TACCTTGTTACGACTT-3 DB15/T 3438 2024 9 D D 附录D（资料 性）羊产气 荚膜 梭菌 序列 的扩 增 D.1 表D.1 用于 羊产 气荚 膜梭 菌序 列 扩增的 引物-F 5-TTACTGCCGTTGATAGCG-3-R 5-TCATTTCCTGGGTTGTCC-3 DB15/T 3438 2024 10 参考文 献 1.2017.2.2018.