大球盖菇液体菌种生产技术规程DB5117／T 94—2024.pdf

D B 5 1 1 7四 川 省（达 州 市）地 方 标 准D B 5 1 1 7/T 9 4 2 0 2 4大 球 盖 菇 液 体 菌 种 生 产 技 术 规 程T e c h n i c a l r e g u l a t i o n s o f l i q u i d s p a w n c u l t u r e b y S t r o p h a r a r u g o s o a n n u l a t a2 0 2 4-0 3-2 8 发 布 2 0 2 4-0 4-1 5 实 施达 州 市 市 场 监 督 管 理 局发 布I C S 6 5.0 2 0.2 0C C S B 3 1D B 5 1 1 7/T 9 4-2 0 2 4I前 言本 文 件 按 照 G B/T 1.1-2 0 2 0 标 准 化 工 作 导 则 第 1 部 分：标 准 化 文 件 的 结 构 和 起 草 规 则 的 规 定起 草。请 注 意 本 文 件 的 某 些 内 容 可 能 涉 及 专 利。本 文 件 的 发 布 机 构 不 承 担 识 别 这 些 专 利 的 责 任。本 文 件 由 达 州 市 农 业 科 学 研 究 院 提 出。本 文 件 由 达 州 市 农 业 农 村 局 归 口。本 文 件 起 草 单 位：达 州 市 农 业 科 学 研 究 院。本 文 件 主 要 起 草 人：赵 辉、孙 传 齐、何 雪 梅、李 彪、王 志 德、马 洁、付 亮、赖 泉 淏、邓 力。D B 5 1 1 7/T 9 4-2 0 2 41大 球 盖 菇 液 体 菌 种 生 产 技 术 规 程1 范 围本 文 件 规 定 了 大 球 盖 菇 液 体 菌 种 生 产 条 件、菌 种 选 择、液 体 菌 种 生 产 技 术 及 工 艺 流 程、档 案 记 录 与贮 藏 等 技 术。本 文 件 适 用 于 大 球 盖 菇 液 体 菌 种 的 生 产。2 规 范 性 引 用 文 件下 列 文 件 中 的 内 容 通 过 文 中 的 规 范 性 引 用 而 构 成 本 文 件 必 不 可 少 的 条 款。其 中，注 日 期 的 引 用 文 件，仅 该 日 期 对 应 的 版 本 适 用 于 本 文 件；不 注 日 期 的 引 用 文 件，其 最 新 版 本（包 括 所 有 的 修 改 单）适 用 于 本文 件。G B 1 5 0 钢 制 压 力 容 器G B 5 7 4 9 生 活 饮 用 水 卫 生 标 准G B/T 1 2 7 2 8 食 用 菌 术 语G B/T 1 3 5 5 4 高 效 空 气 过 滤 器G B 2 2 2 0 7 容 积 式 空 气 压 缩 机 安 全 要 求G B 5 0 0 7 3 洁 净 厂 房 设 计 规 范N Y/T 5 2 8 食 用 菌 菌 种 生 产 技 术 规 程N Y 5 0 9 9 无 公 害 食 品 食 用 菌 栽 培 基 质 安 全 技 术 要 求3 术 语 和 定 义G B/T 1 2 7 2 8 界 定 的 以 及 下 列 术 语 和 定 义 适 用 于 本 文 件。3.1大 球 盖 菇 l i q u i d s p a w n o f s t r o p h a r a r u g o s o a n n u l a t a别 名 皱 环 球 盖 菇、皱 球 盖 菇、酒 红 球 盖 菇、裴 氏 球 盖 菇、赤 松 茸，隶 属 于 担 子 菌 亚 门、层 菌 纲、伞菌 目、球 盖 菇 科、球 盖 菇 属 食 用 菌（s t r o p h a r a r u g o s o a n n u l a t a）。3.2液 体 菌 种 l i q u i d s p a w n菌 丝 体 及 其 生 长 基 质 组 成 的 液 体 繁 殖 材 料，包 括 用 于 发 酵 罐 菌 种 扩 繁 的 摇 瓶 液 体 菌 种、用 于 代 料 栽培 发 酵 罐 菌 种。3.3液 体 菌 种 发 酵 罐 c u l t i v a t i o n a p p a r a t u s f o r l i q u i d s p a w nD B 5 1 1 7/T 9 4-2 0 2 42也 称 液 体 菌 种 培 养 罐，进 行 液 体 菌 种 培 养 的 不 锈 钢 专 用 设 备。3.4发 酵 罐 空 消 e m p t y f e r m e n t e r s t e r i l i z a t i o n对 尚 未 加 水 投 料 的 空 发 酵 罐 进 行 高 压 灭 菌。3.5发 酵 罐 实 消 f e r m e n t e r s t e r i l i z a t i o n对 投 料 后 的 发 酵 罐 进 行 高 压 蒸 汽 灭 菌。3.6液 体 菌 种 接 种 器 l i q u i d i n t e r f a c e t r a p i n o c u l a t o r s将 发 酵 罐 中 液 体 菌 种 转 接 到 固 体 培 养 料 的 无 菌 设 备。3.7接 种 量 i n o c u l a t i o n a m o u n t接 入 发 酵 罐 的 菌 种 数 量，以 菌 种 体 积 与 培 养 基 体 积 的 百 分 比 表 示。3.8终 止 p H i n i t i a l p H v a l u e o f m e d i u m液 体 菌 种 达 到 放 灌 指 标 时 的 培 养 基 p H。3.9放 罐 e m p t y p o t液 体 菌 种 菌 丝 生 长 达 到 生 长 对 数 期 时，从 发 酵 罐 通 过 传 送 管 在 0.1 5 M P a 无 菌 条 件 下 将 菌 种 注 射 到固 体 培 养 料 中。4 生 产 条 件4.1 技 术 人 员具 有 食 用 菌 液 体 菌 种 生 产 或 检 验 从 业 资 格 证 的 专 业 技 术 人 员。4.2 生 产 环 境4.2.1 基 本 要 求空 气 优 良、地 势 高 燥、交 通 方 便、通 风 良 好、水 源 电 源 充 足、排 水 畅 通，其 中 水 源 应 符 合 G B 5 7 4 9的 规 定。4.2.2 环 境 卫 生 要 求大 球 盖 菇 液 体 菌 种 生 产 场 所 应 有 硬 质 路 面、排 水 良 好，远 离 畜 禽 养 殖 场、排 污 口、工 矿 业“三 废”及 微 生 物、烟 尘 和 粉 尘 等 污 染 源。4.2.3 液 体 菌 种 生 产 场 所D B 5 1 1 7/T 9 4-2 0 2 43地 面 应 能 防 水、防 腐 蚀、防 渗 漏、防 滑，易 清 洗，应 有 1.0 1.5 的 排 水 坡 度 和 良 好 的 排 水 系 统，排 水 沟 应 是 圆 弧 式 的 明 沟。墙 壁 和 天 花 板 应 能 防 潮、防 霉、防 水、易 清 洗。4.3 生 产 设 施、设 备4.3.1 设 施原 料 库、配 料 间、发 菌 间、冷 却 间、接 种 间、培 养 室、检 测 室 规 模 配 套，布 局 合 理，有 调 温 设 施。设 计 应 符 合 G B 5 0 0 7 3 的 要 求。发 菌 间 应 配 备 水、电（停 电 需 配 备 发 电 机)、蒸 汽、空 气 四 大 动 力 系 统，建 立 万 级 局 部 百 级 无 菌 室净 化 操 作 室，保 障 液 体 菌 种 生 产。4.3.2 设 备液 体 菌 种 培 养 器、高 效 空 气 过 滤 器、液 体 菌 种 接 种 器、高 压 蒸 汽 灭 菌 锅、蒸 汽 锅 炉、超 净 工 作 台、恒 温 摇 床、恒 温 培 养 箱、冰 箱、普 通 光 学 显 微 镜、磁 力 搅 拌 机、磅 秤、天 平、酸 度 计 等。其 中 液 体 菌 种培 养 器、高 效 空 气 过 滤 器、高 压 灭 菌 锅 和 蒸 汽 锅 炉 应 检 验 合 格，符 合 G B 1 5 0、G B/T 1 3 5 5 4、G B 2 2 2 0 7的 要 求。4.3.3 培 养 基 质应 符 合 N Y 5 0 9 9 的 规 定。5 菌 种 选 择应 选 用 经 省 级 以 上 非 主 要 农 作 物 品 种 审 定 委 员 会 审（认）定 或 登 记（备 案）的 高 产、优 质、抗 逆 性强、商 品 性 好 的 品 种，菌 种 生 产 应 符 合 N Y/T 5 2 8 的 规 定。6 液 体 菌 种 生 产 技 术 要 求6.1 液 体 菌 种 生 产 工 艺 流 程 图液 体 菌 种 生 产 工 艺 流 程 图 见 图 1。图 1 液 体 菌 种 生 产 工 艺 流 程 图D B 5 1 1 7/T 9 4-2 0 2 446.2 生 产 要 求6.2.1 母 种 制 备应 符 合 N Y/T 5 2 8 要 求。母 种 培 养 基 配 方：马 铃 薯（煮 汁）2 0 0 g/L，葡 萄 糖 2 0 g/L，琼 脂 粉 2 0 g/L，p H 自 然。6.2.2 摇 瓶 菌 种 制 备6.2.2.1 培 养 基 配 制 与 分 装按 照 附 录 A 中 A.1 的 配 方 配 制 培 养 基，用 水 应 符 合 G B 5 7 4 9 的 要 求。培 养 基 用 5 0 0 m l 三 角 瓶 分 装，装 量 为 每 瓶 1 5 0 m l 2 5 0 m l，瓶 口 用 1 4 c m 1 4 c m P P 聚 丙 烯 膜 封 口 并 用 耐 高 温 塑 料 胶 圈 扎 紧。6.2.2.2 灭 菌1 2 3、0.1 4 M P a 灭 菌 3 0 m i n，期 间 在 压 力 升 到 0.1 M P a 时，打 开 放 气 阀 排 尽 冷 空 气。灭 菌 结 束 后，自 然 焖 锅 降 压，防 止 培 养 基 外 溢。6.2.2.3 冷 却将 灭 菌 后 的 液 体 培 养 基 放 入 超 净 工 作 台 中，冷 却 至 2 0 2 5。6.2.2.4 接 种在 无 菌 条 件 下，严 格 按 无 菌 操 作 要 求 接 种。用 接 种 针 挑 取 5 6 块 3 m m 5 m m 的 母 种 块 迅 速 转 接 于摇 瓶 培 养 基 内，每 支 母 种 接 5 瓶 7 瓶，接 种 后 及 时 贴 好 标 签。6.2.2.5 培 养接 种 前 2 d，用 臭 氧 发 生 器 和 7 5%酒 精 分 别 对 培 养 室 及 培 养 器 消 毒。接 种 后 放 入 2 5 恒 温 箱 中 静 置培 养 l d，后 置 于 恒 温 摇 床 上 培 养，温 度 控 制 在 2 5 2 8，转 速 1 4 0 r/m i n 1 6 0 r/m i n，培 养 时 间 6 d 7 d至 菌 液 出 现 直 径 3 m m 5 m m 均 匀 菌 丝 球。期 间 每 天 观 察，及 时 去 除 污 染 菌 种。6.2.3 液 体 菌 种 制 备6.2.3.1 投 料 前 准 备检 查 罐 上 全 部 阀 门、安 全 阀、压 力 表，要 求 完 好、工 作 正 常。对 罐 内、外 和 全 部 阀 门 用 流 水 冲 洗，达 到 无 死 角、内 壁 无 任 何 残 留 物。在 发 酵 罐 中 加 入 适 量 的 水（距 离 观 察 窗 下 边 缘 5 c m 左 右)，完 全 打 开罐 体 上 排 气 阀 门，将 排 气 管 接 入 下 水 管 道，将 无 菌 空 气 接 入 发 酵 罐 底 部 的 进 气 口，通 入 无 菌 空 气，让 进气 气 压 表 维 持 0.0 1 M p a。6.2.3.2 培 养 基 制 备应 符 合 N Y/T 5 2 8、G B 5 7 4 9 要 求。培 养 基 配 方 见 附 录 A 中 A.2，其 中 黄 豆 粉、玉 米 粉 需 过 直 径 0.1 5m m 的 孔 筛。6.2.3.3 煮 罐 和 空 消培 养 器 初 次 使 用、出 现 杂 菌、长 期 放 置、更 换 品 种 时，都 要 在 1 2 1、0.1 2 M P a 下 灭 菌 4 0 m i n 进行 煮 罐 和 空 消。6.2.3.4 投 料 和 定 容将 附 录 A 中 A.2 的 原 材 料 用 温 水 溶 解 后 倒 入 发 酵 罐 中。加 水 定 容 至 所 需 体 积，培 养 基 投 料 量 为 罐体 总 容 积 的 7 0%，加 入 0.0 3%消 泡 剂 后 清 理 加 料 口 至 无 残 留 物 料，拧 紧 上 料 口 盖。6.2.3.5 气 动 搅 拌D B 5 1 1 7/T 9 4-2 0 2 45调 整 控 温 箱 温 度 至 1 2 5，打 开 罐 体 加 热 棒 开 始 对 罐 体 进 行 加 热，在 1 0 0 之 前 一 直 开 启 罐 体 夹 层出 水 阀，以 放 掉 夹 层 里 的 虚 压 和 多 余 的 水。温 度 在 7 0 以 下 时 打 开 空 气 压 缩 机 通 过 储 气 罐 和 空 气 过 滤器 对 罐 体 培 养 基 进 行 气 动 搅 拌，防 止 罐 内 液 体 结 块。6.2.3.6 液 体 培 养 基 灭 菌当 罐 体 内 培 养 基 达 7 0 时，关 闭 气 泵。当 夹 层 出 水 阀 出 热 蒸 汽 3 m i n 5 m i n 后 关 闭。发 酵 罐 内 蒸 汽压 力 达 到 0.1 0 5 M p a 0.1 2 5 M p a，温 度 达 到 1 2 1 1 2 4，保 持 时 间 1 小 时。6.2.3.7 冷 却、调 压灭 菌 结 束，开 启 冷 水 阀 门 将 冷 水 通 入 发 酵 罐 夹 层 或 者 内 置 冷 却 系 统 中 循 环 降 温，夹 层 内 冷 却 循 环 水排 出。待 温 度 降 至 1 0 0，罐 压 降 至 0.0 8 M p a，开 始 通 入 无 菌 空 气，打 开 上 排 气 阀，持 续 通 入 冷 凝 水。待 温 度 降 至 2 6，停 止 通 入 冷 凝 水，调 整 排 气 口 与 无 菌 空 气 进 气 阀 门，使 罐 内 压 力 维 持 在 0.0 5 M p a。6.2.3.8 接 种接 种 应 按 照 下 列 步 骤 完 成：在 接 种 口 底 部 点 燃 火 焰 圈；调 节 排 气 阀，使 罐 内 压 力 降 至 0.0 1 M p a；打 开 进 料 口 盖，在 火 焰 上 打 开 摇 瓶 菌 种，灼 烧 瓶 口 后 倒 入 发 酵 罐 中，接 种 量 为 0.5%1%；用 火 焰 灼 烧 接 种 口 盖，迅 速 拧 紧 进 料 口 盖，移 走 火 焰 圈，调 整 罐 压 保 持 在 0.0 5 M p a。6.2.3.9 菌 种 培 养通 过 气 泵 充 气 和 调 整 放 气 阀 调 节 罐 体 压 力 至 0.0 2 M P a 0.0 3 M P a，温 度 控 制 在 2 4 1、通 气 量 为1:0.8 条 件 下 进 行 液 体 菌 种 培 养。6.2.3.1 0 检 验接 种 后 第 4 d 进 行 检 测，感 官 检 验 指 标（见 附 录 B）。首 先 用 酒 精 火 焰 球 灼 烧 取 样 阀 3 0 s 4 0 s 后，弃 掉 最 初 流 出 的 少 量 液 体 菌 种，然 后 用 酒 精 火 焰 封 口 直 接 放 入 经 灭 菌 的 三 角 瓶 中，塞 紧 棉 塞，取 样 后 用酒 精 火 焰 把 取 样 阀 烧 干，以 免 杂 菌 进 入 造 成 污 染。将 样 品 带 入 接 种 箱 接 入 试 管 斜 面 或 平 板 培 养 基 上，放入 2 5 恒 温 培 养 4 8 h 7 2 h，观 察 菌 丝 生 长 状 况 和 有 无 杂 菌 污 染；若 无 细 菌、霉 菌 等 杂 菌 菌 落 生 长，则表 明 该 样 品 无 杂 菌 污 染。6.2.3.1 1 放 罐 接 种培 养 6 d 7 d 后，观 察 培 养 状 况，达 到 放 罐 指 标（见 附 录 C）即 可 放 罐。放 罐 前 4 8 小 时 应 对 液 体 菌种 进 行 批 次 抽 样 检 测，质 量 合 格 即 可 用 于 接 种。终 止 发 酵 后，罐 内 外 温 度 均 应 保 持 在 2 4 土 1，4小 时 内 完 成 接 种。接 种 环 境 应 符 合 G B 5 0 0 7 3 标 准 要 求，液 体 接 种 器 应 经 高 压 灭 菌 后 使 用，每 袋（瓶）接 种 量 1 5 m L 3 0 m L。6.2.3.1 2 留 样 与 检 验菌 种 和 培 养 基 均 应 留 样，2 4 保 存 7 d 备 查。母 种 应 以 每 个 批 号 3 支 5 支，于 4 6 下 贮 存，贮 存 至 经 转 接 的 栽 培 袋 正 常 发 菌；摇 瓶 菌 种 使 用 时 取 样 3 0 m L 4 0 m L，用 三 角 瓶 留 存；发 酵 罐 实 消 后 的 空 白 培 养 基 取 样 3 0 m L 4 0 m L，用 三 角 瓶 留 存；放 罐 前 4 8 小 时 从 发 酵 罐 中 取 样 3 0 m L 4 0 m L，用 三 角 瓶 留 存；发 酵 终 止 后 取 样 8 0 m L 1 0 0 m L，用 三 角 瓶 留 存。7 档 案 记 录母 种、摇 瓶 液 体 种 和 发 酵 罐 液 体 菌 种 生 产 的 每 个 环 节 应 由 具 体 操 作 人 员 现 场 填 写 详 实 的 生 产 记 录，定 期 审 核、签 字 后 归 档，生 产 记 录 档 案 应 保 留 至 本 批 次 菌 种 栽 培 出 菇 为 止。D B 5 1 1 7/T 9 4-2 0 2 468 贮 藏 与 运 输8.1 贮 藏8.1.1 不 能 立 即 使 用，应 进 行 贮 藏。贮 藏 环 境 温 度 应 低 于 2 0。8.1.2 发 酵 罐 内 液 体 菌 种，持 续 通 无 菌 空 气，保 持 罐 压 0.0 2 M P a 0.0 3 M P a，可 存 放 2 d。8.2 运 输大 球 盖 菇 液 体 菌 种 不 宜 长 途 运 输，生 产 后 应 立 即 使 用。D B 5 1 1 7/T 9 4-2 0 2 47附 录 A(资 料 性)大 球 盖 菇 液 体 菌 种 培 养 基 建 议 配 方A.1 摇 瓶 液 体 培 养 基 配 方摇 瓶 液 体 培 养 基 配 方 如 下：a）马 铃 薯（煮 汁）2 0 0 g/L，葡 萄 糖 2 0 g/L，磷 酸 二 氢 钾 1.5 g/L，硫 酸 镁 1.5 g/L，p H 自 然。b）葡 萄 糖 2 0 g/L，蛋 白 胨 2.5 g/L，磷 酸 二 氢 钾 1.0 g/L，硫 酸 镁 1.0 g/L，维 生 素 B 1 1 0 m g/L，p H 自 然。A.2 发 酵 罐 液 体 培 养 基 配 方发 酵 罐 液 体 培 养 基 配 方 如 下：a）蔗 糖 8.7 5 g/L，葡 萄 糖 8.7 5 g/L，淀 粉 3.1 g/L，V B 1 5 m g/L，麸 皮 2.5 g/L，豆 粉 1.2 5 g/L，酵 母 膏 0.5 g/L，磷 酸 二 氢 钾 1.2 5 g/L，硫 酸 镁 0.1 2 5 g/L，消 泡 剂 0.1 5 g/L，p H 自 然。b）玉 米 粉 1.0 g/L，黄 豆 粉 1.5 g/L，葡 萄 糖 7.5 g/L，酵 母 膏 1.5 g/L，磷 酸 二 氢 钾 0.5 g/L，硫 酸 镁 0.2 5g/L，p H 自 然。c）葡 萄 糖 2 0 g/L、蛋 白 陈 3 g/L、磷 酸 二 氢 钾 1 g/L、硫 酸 镁 0.5 g/L、维 生 素 B 1 5 m g/L、消 泡 剂 0.3 g/L，p H 自 然。d）马 铃 薯 汁 2 0 0 g/L、葡 萄 糖 2 0 g/L、磷 酸 二 氢 钾 1 g/L、硫 酸 镁 0.5 g/L、维 生 素 B 1 1 0 m g/L、消 泡 剂 0.3 g/L，p H 自 然。D B 5 1 1 7/T 9 4-2 0 2 48附 录 B（资 料 性）检 验 项 目检 验 项 目 参 见 表 B.1。表 B.1 检 验 项 目项目 指标 检验方法菌液颜色 菌液淡黄色或黄褐色。肉眼观察菌液形态、透明度 菌 液 均 匀 不 分 层，菌 丝 体 稠 密，菌 丝球均匀、细小；菌液清澈透明。肉眼观察菌液气味 排 气 口 气 味 正 常，无 酸、臭 味、酒 精味等。鼻嗅杂菌检测 划 痕 处 无 霉 菌、细 菌、酵 母 菌 等 菌 落生长取样接种至 P D A 培养基上划线，在 2 5 恒温培养 2 4 h 4 8 h，观察是否有污染D B 5 1 1 7/T 9 4-2 0 2 49附 录 C(资 料 性)放 罐 指 标放 罐 指 标 参 见 表 C.1。表 C.1 放 罐 指 标项目 指标菌液颜色和透明度 球状菌丝体白色，菌液呈淡黄色或黄褐色，清澈透明。菌液形态 菌液粘度高，静置基本不分层；菌丝体稠密，菌球悬浮力好、在菌液中分布均匀，菌球大小均匀，菌球间液不混浊。菌液气味 无异味，如酸、臭味、发酵酒精味等，发酵罐排气口气味正常，有大球盖菇菌丝特有芳香气或无明显改变。菌 丝 显 微 形 态 和 杂 菌 鉴别可见大球盖菇菌种液体培养中特有的菌丝形态，大量分枝菌丝分布，菌丝粗壮，有锁状联合，菌丝内原生质分布均匀、染色剂着色深。无霉菌菌丝、酵母和细菌菌体。终止 p H 5.5 6.5菌丝干重（g/1 0 0 m l）0.8