规模化羊场绵羊支原体肺炎诊断及免疫技术规程DB15／T 3439—2024.pdf

ICS 65.020.30 CCS B 41 15 内蒙古自治区地方标准 DB15/T 3439 2024 规模化羊 场 绵羊支 原体肺炎 诊断及免 疫 技术规程 Technical protocols for diagnosis and immunization of mycoplasma ovipneumoniae on large scale sheep farms 2024-05-31 发布 2024-07-01 实施 内蒙古自 治区市 场 监督管理 局 发 布 DB15/T 34392024 I 前 言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC 19）归口。本文件起草单位：内蒙古自治区农牧业科学院，五原县动物疫病预防控制中心，内蒙古盛健生物科技有限责任公司，内蒙古金草原生态科技集团有限公司，内蒙古杜美牧业生物科技有限公司。本文件主要起草人：戴伶俐、白帆、王娜、宋越、张帆、张月梅、赵世华、刘威、杨斌、钱琳娜、达来宝力格、凤英、郭天龙、李慧、张英、王强胜、杨文圃、王建光、刘学文。DB15/T 34392024 1 规模化羊 场绵羊 支原体肺 炎诊断 及免疫技 术规程 1 范围 本文件规定了规模化羊场绵羊支原体肺炎诊断及免疫技术。本文件适用于规模化羊场绵羊肺炎支原体感染的临床诊断、实验室检测和免疫。2 规范性 引用 文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法。GB/T 18635 动物防疫 基本术语 NY/T 2835 奶山羊饲养管理技术规范 NY/T 3052 舍饲肉羊饲养管理技术规范 3 术语和 定义 GB/T 18635 界定的以及下列术语和定义适用于本文件。绵羊肺 炎支 原体 mycoplasma ovipneumoniae（Mo）属于柔膜纲（Mollicutes）支原体科（Mycoplasmataceae）支原体属（Mycoplasma）成员。Mo直径约125 nm500 nm，无细胞壁。Mo合成能力差，需要在培养基中加入酵母浸出液和20%的马血清进行培养。在固体培养基上形成针尖大小的透明菌落，肉眼不易观察，低倍镜下观察菌落呈“桑葚状”，中心无脐，边缘不整齐。Mo在55 条件下5 min15 min即可被彻底灭活，对常用的盐类、来苏水、石碳酸等消毒剂敏感，对大部分大环内酯类和四环素类抗生素敏感。Mo由于没有细胞壁，对青霉素、醋酸铊有抵抗力。规模化 羊场 large-scale sheep farm 存栏羊300只以上的羊场。聚合酶 链式 反应 polymerase chain reaction（PCR）一种级联反复循环的DNA合成反应过程。一般由三个步骤组成：模板的热变性，寡核苷酸引物复性到单链靶序列上以及由热稳定DNA聚合酶催化的复性引物引导的新生DNA链延伸聚合反应。DB15/T 34392024 2 间接酶 联免 疫吸 附试 验 indirect enzyme-linked immunosorbentassay（间 接ELISA）已知的抗原吸附在固相载体(聚苯乙烯微量反应板，也称酶标板)表面，样品中待检测抗体于抗原结合形成复合物，再用酶标二抗与复合物中的抗体结合，最后加入底物，用分光光度计测定加底物后的显色程度，确定待测抗体的方法。4 临床诊 断 流行特 点 绵羊肺炎支原体主要侵害绵羊和山羊，各日龄羊均可发病，以3月龄以下的羔羊为主，身体状况差，机体抵抗力下降的羊更易感染。绵羊肺炎支原体在自然条件下可以通过空气-飞沫（气溶胶）传染，引发传染性胸膜肺炎。病畜通过咳嗽、打喷嚏、唾沫等向外界传播病原。Mo引起的肺炎常呈地方流行性，一年四季都发，其中夏末和冬季频发。环境因素也会导致本病流行，阴雨连绵、寒冷潮湿、羊群密集、拥挤等因素容易引起传染的发生。发病率因地域和养殖模式而有所不同。临床症 状 绵羊肺炎支原体感染的羊临床上主要表现为发热、咳嗽、流涕、消瘦、贫血、生长发育迟缓、食欲减退等症状。有的病羊有腹胀、腹泻、口腔溃疡、腰背拱起等症状出现。病理变 化 典型病变主要集中于肺脏中，病程缓急、严重程度不同呈现出虾肉样、大理石样、肝变样。严重时肺脏与胸腔粘连，出现胸腔积液。尖叶病变严重，心叶和膈叶次之，其他器官的病变不明显。5 实验室 诊断 样品采 集 5.1.1 鼻拭子 样本 采集 鼻拭子采集后置装有0.5 mL1.0 mL 灭菌生理盐水的无菌离心管中，盖严，冷藏条件下快速送检。5.1.2 气管分 泌物 样本 采集 气管分泌物可直接收集，冷藏条件下快速送检。5.1.3 血清样 本采 集 颈静脉无菌采血3 mL5 mL，室温放置1 h后4 放置过夜，室温3000 rpm 离心5 min10 min，分离血清，于-20 保存。所有样本均应妥善包装，防渗漏，防破碎。标签用记号笔填写，应信息完整，字迹清晰，并附采样单。5.1.4 肺组织 样本 采集 DB15/T 34392024 3 无菌条件下取样，在肺组织病变与正常组织交界处，取3 cm35 cm3大小的组织样本，冷藏条件下快速送检或置无菌40%50%甘油生理盐水中，冷藏条件下快速送检。病原的 分离 鉴定 5.2.1 仪器 电子天平，光学显微镜，恒温摇床，生物安全柜等。5.2.2 耗材 微量可调移液器及配套吸头，10 mL无菌离心管，涂布棒，0.45 m滤器，一次性培养皿，一次性培养瓶。5.2.3 试剂与 配制 支原体液体培养基，支原体固体培养基，马血清，1%醋酸铊，8万单位青霉素。培养基及试剂配制参见附录A。5.2.4 肺组织 样本 处理 在表层消毒后，在病变和正常组织交界处取米粒至绿豆大小深层肺组织置于玻璃匀浆器中，加入3 mL4 mL灭菌PBS，反复挤压组织块，制成组织悬液。将组织悬液自然沉淀10 min，取上部液体通过0.22 m孔径的滤膜过滤后，将滤液作为待检样本。5.2.5 病原菌 分离 培养 滤液加入10 mL支原体液体培养基中（含醋酸铊和青霉素），37，150 rpm 培养48 h72 h，液体变为橙红色，取1 mL培养产物转入10 mL培养基中，传代培养，盲传三代后，取3 mL培养液提取基因组DNA用于PCR检测。5.2.6 病原形 态观 察 培养物涂布于含醋酸铊和青霉素的支原体固体培养基中，置于37 培养3 d7 d，待培养板表面生长出肉眼可见的半透明菌落，用显微镜观察菌落形态，边缘不整齐，呈现“桑葚状”菌落，无脐。（见附录C.1）5.2.7 染色镜 检 取培养物作涂片，用瑞士染色，镜检可见具有多形性、小球状、杆状等，两极着色，许多聚集成团，直径约为0.2 m（见附录C.2）。5.2.8 病原生 化鉴 定 5.2.8.1 生化管 葡萄糖、甘露醇、精氨酸、尿素、磷酸酶等生化管为商品化试剂。5.2.8.2 对照菌 株 绵羊肺炎支原体Y98标准株。5.2.8.3 操作方 法：DB15/T 34392024 4 吸取10 L绵羊肺炎支原体液体纯培养物，分别深部接种于各种生化管中，置于37 恒温培养箱中，12 h24 h后观察结果。绵羊肺炎支原体分解葡萄糖、不分解甘露醇、精氨酸和尿素，无磷酸酶活性，绵羊肺炎支原体生化反应鉴别见附录C。5.2.9 病原分 离判 定 液体培养基培养产物使培养基变橙红，菌液呈现薄云雾状，不明显浑浊，菌体在培养液中呈现流沙状。菌落特征明显，符合生化反应，初步判定为绵羊肺炎支原体分离阳性，否则判定为未检出绵羊肺炎支原体。PCR 检测 5.3.1 仪器和 耗材 PCR仪，电炉，离心机，混匀器，微量可调移液器，1.5 mL 离心管，PCR反应管，核酸电泳仪，凝胶成像系统。5.3.2 试剂 灭菌双蒸水，TaqMix，琼脂糖，细菌基因组 DNA提取试剂盒。5.3.3 样品处 理 5.3.3.1 拭子样 品 鼻拭子样本于采集管中涡旋5 min，取400 L悬液，4，12000 rpm离心20 min，弃上清，沉淀用细菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA。5.3.3.2 气管分 泌物 样品 气管分泌物样品于采集管中涡旋5 min，取400 L悬液，4，12000 rpm离心20 min，弃上清，沉淀用细菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA。5.3.3.3 菌液样 品 培养产物取3 mL于4，12000 rpm离心20 min，弃上清，沉淀用细菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA。5.3.4 引物序 列 见附录D。5.3.5 PCR 反 应体 系 总体积20 L，其中2Taq Mix 10 L，上下游引物(10 mol/L)各1 L，绵羊肺炎支原体DNA模板1.0 L，去离子水7 L。5.3.6 PCR 反 应条 件 94 预变性5 min后，94 变性30 s，55 退火30 s，72 延伸30 s，30个循环后，72 延伸7 min。5.3.7 PCR 反 应产 物检 测 DB15/T 34392024 5 将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪下观察，PCR产物大小应为350 bp(见附录C.3)。对照设置：对照模板为绵羊肺炎支原体Y98标准株基因组DNA。结果判定：电泳检测PCR产物大小为350 bp，与阳性对照产物大小相同，无模板对照为无目的条带，判定为绵羊肺炎支原体阳性。间接ELISA 检测 血清 抗体 5.4.1 主要试 剂耗 材 酶联反应板，离心管，PBS缓冲液，吐温-20，脱脂乳，HRP标记兔抗绵羊抗体，HRP标记兔抗山羊抗体，1 M硫酸溶液。除另有规定，所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T 6682的超纯水。5.4.2 主要仪 器设 备 酶标仪、恒温培养箱、微孔板振荡器、微量移液器。5.4.3 血清及 抗原 制备 流程 5.4.3.1 阳性血 清对 照 分离鉴定并经测序确定为绵羊肺炎支原体的菌液制备全菌灭活抗原，并用其免疫3月龄羔羊制备标准阳性血清，经间接血凝实验验证为阳性。5.4.3.2 阴性血 清对 照 无母源抗体，经间接血凝实验结果为阴性。5.4.3.3 抗原制 备 绵羊肺炎支原体菌液100 mL，4 12000 rpm离心30 min，弃上清，取沉淀。将菌体沉淀用0.1 M pH7.4的PBS缓冲液洗涤3次，用5 mL PBS 重悬。菌体重悬液超声裂解，4 12000 rpm离心30 min，收集上清，即为绵羊肺炎支原体全菌抗原。用BCA法测定蛋白质浓度，将抗原冻存于-20 备用。5.4.4 检测流 程 5.4.4.1 抗原包 被 将上述抗原用0.05 mol/L、pH 9.6的碳酸盐缓冲液(CBS)，即包被液，稀释为4 g/mL，按100 L/孔 加入至酶联反应板，置4 冰箱过夜，次日弃包被液，用PBST洗涤酶联反应板3次。5.4.4.2 封闭 封闭液：为含5%脱脂乳的PBST溶液。用移液器向酶联反应板加入新鲜配制的封闭液，300 L/孔，37 恒温箱孵育1 h；取出后加PBST，300 L/孔，洗板3次。5.4.4.3 ELISA 检测 程序 加样：用封闭液按体积比1:100稀释待检血清、阳性、阴性对照血清，每个样本做2个平行复孔，稀释后血清100 L/孔，37 恒温箱孵育1 h，用PBST洗板3次。加酶结合物：取稀释好的酶结合物，酶联反应板100 L/孔加注，37 恒温箱孵育50 min，洗涤同前。DB15/T 34392024 6 加底物显色：将底物液A和底物液B等体积混合制成的TMB底物显色液按100 L/孔加注，室温避光作用20 min，用 1 M硫酸终止液100 L/孔，终止显色反应。数据读取：用酶标仪在波长450 nm处测定每孔的吸收值，每个样品每次平行2孔，取其平均值。5.4.4.4 血清抗 体检 测结 果判 定 待检样本S，阳性对照P，阴性对照N。阳性对照P值应大于0.8，阴性对照值应小于0.2，待检验本S/阴性对照N比值2.1即判定为阳性，待检验本S/阴性对照N比值2.1，即判定为阴性。综合判 定 临床诊断符合绵羊肺炎支原体症状，病原鉴定为阳性或PCR鉴定为阳性，即可判定为绵羊肺炎支原体感染阳性。未免疫绵羊肺炎支原体疫苗的羊只血清抗体检测为阳性，则可判定为已感染绵羊肺炎支原体。6 防控措 施 综合管 理措 施 6.1.1 饲养管 理 按照NY/T 2835和NY/T 3052的要求，加强饲养管理、保障动物福利、减少应激。6.1.2 消毒措 施 严格做好羊舍内外环境、用具、物品的消毒，以及人员消毒。疫苗免 疫 6.2.1 疫苗选 择 疫苗选择：a)选择针对性疫苗，经中国兽药网注册公布的疫苗；b)每次免疫时，最好选用同一企业生产的疫苗。6.2.2 推荐免 疫程 序 参见附录E，针对不同生长阶段羊，采取适宜的免疫接种程序。治疗原 则 选择对绵羊肺炎支原体敏感的大环内酯类、强力霉素、氟苯尼考等抗生素，在做好全进全出、加强饲养管理与卫生消毒工作及提高生物安全标准的基础上，根据羊群具体情况制定用药方案。DB15/T 34392024 7 A A 附录A（资料 性）主要培 养基 及试 剂的 配制 A.1 支原体液体培养基：将 PPLO肉汤粉 10.5 g，酵母粉2.5 g，丙酮酸钠0.5 g，溶于 440 mL超纯水中，116 灭菌20 min后，添加马血清 50 mL，10MEM 5mL,8万单位/mL青霉素溶液 5 mL，1%酚红溶液500 L，定容至500 mL，置 4 保存备用。A.2 支原体固体培养基：将 PPLO肉汤粉 10.5 g，酵母粉2.5 g，丙酮酸钠0.5 g，琼脂粉 7.5 g，溶于440 mL超纯水中116 20 min25 min 后，添加马血清50 mL，无菌 10DMEM 5 mL,8 万国际单位/mL青霉素溶液5 mL,定容至500 mL，倒平板，待培养基凝固后，置 4 保存备用。A.3 TAE电泳缓冲液：Tris 4.84 g/L,冰乙酸 1.142 mL/L，EDTA(pH 8.0)，0.001 mmol/L,定容至 1000 mL。A.4 PBS缓冲液（pH7.27.4）：NaCl 137 mmol/L，KCl 2.7 mmol/L，Na2HPO4 4.3 mmol/L，KH2PO4 1.4 mmol/L。用 HCl调 pH值至7.4，定容至 1000 mL，121，30 min高压灭菌。A.5 8万国际单位/mL青霉素溶液：取 400万国际单位的青霉素粉剂，溶于 50 mL双蒸水中,至完全溶解后，0.22 m 细菌滤器过滤除菌，滤液置 4 保存备用。A.6 1%酚红溶液：称取 1 g 酚红加入1 M NaOH 溶液 2 mL，不断搅拌，将已经溶解的酚红溶液倒入容器中；未溶解的酚红继续加 1 M NaOH 溶液 2 mL，重复上述步骤（NaOH溶液总量不可超过 6 mL）；加双蒸水至100 mL，121 灭菌15 min后，至 4 保存。A.7 琼脂糖1%琼脂糖凝胶：琼脂糖粉 1 g，加入TAE 溶液 100 mL，加热充分溶解，趁热倒入核酸电泳槽胶槽中。DB15/T 34392024 8 B B 附录B（资料 性）绵羊肺 炎支 原体 的分 离鉴 定 B.1 绵羊肺炎支原体菌落形态（1040）见图 B.1。图B.1 绵羊 肺炎 支原 体菌 落形 态（1040）B.2 绵羊肺炎支原体瑞士染色（10100）见图 B.2。图B.2 绵羊 肺炎 支原 体瑞 士染 色（10100）DB15/T 34392024 9 B.3 绵羊肺炎支原体特异性引物 PCR电泳图。标引序号说明：MDNA 分子量标准；1鼻拭子样本；2气管分离培养MO；3肺组织分离培养MO；4Y98阳性对照；5气管分泌物样本；6空白对照。图B.3 绵羊 肺炎 支原 体特 异性 引 物PCR 电泳 图 DB15/T 34392024 10 C C 附录C（资料 性）生化反 应鉴 别检 测 绵羊肺炎支原体生化反应鉴别检测的判断依据见表C.1。表C.1 绵羊 肺炎 支原 体生 化反 应 鉴别检 测的 判断 依据 种名 分解葡萄糖 分解甘露糖 水解精氨酸 分解尿素 磷酸酶活性 绵羊肺炎支原体+-精氨酸支原体-+-丝状支原体丝状亚种+-DB15/T 34392024 11 D D 附录D（资料 性）PCR 引 物序 列 绵羊肺炎支原体PCR鉴定的扩增引物见表D.1。表D.1 用于 绵羊 肺炎 支原 体 PCR 鉴定的 引物 引物 序列 MO-F 5-ACGGAATATGTTAGCTT-3 MO-R 5-TTCATCCTGCACTCTGT-3 DB15/T 34392024 12 E E 附录E（资料 性）推荐免 疫程 序 推荐免疫程序见表E.1。表E.1 推荐 免疫 程序 不同生长阶段 推荐免疫程序 注意事项 1 2 周龄 羔羊 按照疫苗说明书免疫接种方式和免疫剂量进行免疫，羔羊在 12 周龄时进行初次免疫，于首免后 23 周再加强免疫一次。免疫羊群应临床表现健康；发病羊及体质弱、体温升高、精神沉郁、食欲不振等非健康状态的羊只不适宜接种；临产怀孕母羊和长途运输后处于应激状态的羊只暂不接种，待其恢复正常后再接种。后备母羊 前期免疫参照羔羊免疫程序，配种前灭活苗颈部皮下注射免疫一次，分娩前 35 周灭活苗颈部皮下注射免疫。生产母羊 羊支原体肺炎防控压力大的羊场，建议跟胎免疫，生产母羊在分娩前 35 周用灭活苗颈部皮下注射免疫（母羊产前免疫可以减少其哺乳期排菌，以免感染哺乳羔羊）；母羊群也可以进行普免，每年两次。