水产品中羧甲基赖氨酸的测定 液相色谱法DB42／T 2242-2024.pdf

ICS 65.150 CCS B 50 DB42 湖 北 省 地 方 标 准 DB42/T 22422024 水产品中羧甲基赖氨酸的测定 液相色谱法 Determination of N-carboxymethyl-L-lysine in aquatic products Liquid chromatography method 2024-05-14发布 2024-07-14实施 湖北省市场监督管理局 发 布 DB42/T 22422024 I 目 次 前言.III 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 原理.1 5 试剂与材料.1 6 仪器与设备.2 7 样品制备与保存.3 8 测定步骤.3 9 精密度.4 10 检出限与定量限.5 附录 A（规范性）水产品的试样制备.6 附录 B（资料性）羧甲基赖氨酸衍生物高效液相色谱图.7 DB42/T 22422024 III 前 言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由湖北省农业农村厅提出并归口。本文件起草单位：湖北省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所、湖北省农业科学院农产品加工与核农技术研究所、湖北省市场监督管理局行政许可技术评审中心、湖北农科质标检测科技有限公司。本文件主要起草人：胡西洲、刘骞、叶芸、彭西甜、陈学玲、张仙、彭茂民、吕昂、陈鑫、朱坤淼、刘军、路磊、周有祥、彭立军。本文件实施应用中的疑问，可咨询湖北省农业农村厅，电话：027-87665821，邮箱：，对本文件的有关修改意见建议请反馈至湖北省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，电话：027-87389465，邮箱：。DB42/T 22422024 1 水产品中羧甲基赖氨酸的测定 液相色谱法 1 范围 本文件描述了用液相色谱法测定水产品中羧甲基赖氨酸含量的原理、试剂与材料、仪器与设备、样品制备与保存、测定步骤、精密度、检出限与定量限。本文件适用于鱼、虾、蟹类等水产品中羧甲基赖氨酸含量的测定。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 30891 水产品抽样规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。羧甲基赖氨酸 N-carboxymethyl-L-lysine（CML）由葡萄糖与赖氨酸发生非酶催化反应生成的一种典型糖化终末产物。4 原理 试样脱脂后经硼氢化钠还原、蛋白水解反应，水解产物通过固相萃取后经衍生，再用高效液相色谱分离，荧光检测器进行测定，外标法定量。5 试剂与材料 试剂 5.1.1 三氯甲烷（CHCl3，CAS号：67-66-3）：分析纯。5.1.2 丙酮（CH3COCH3，CAS 号：67-64-1）：分析纯。5.1.3 盐酸（HCl，CAS号：7647-01-0）：分析纯。5.1.4 氢氧化钠（NaOH，CAS 号：1310-73-2）：分析纯。5.1.5 磷酸二氢钠（NaH2PO4，CAS号：7558-80-7）：分析纯。5.1.6 硼氢化钠（NaBH4，CAS号：16940-66-2）：分析纯。5.1.7 邻苯二甲醛（C8H6O2，CAS号：643-79-8）：分析纯。5.1.8 3-巯基丙酸（C3H6O2S，CAS号：107-96-0）分析纯。5.1.9 甲醇（CH3OH，CAS号：67-56-1）：色谱纯。5.1.10 乙腈（CH3CN，CAS号：75-05-8）：色谱纯。DB42/T 22422024 2 5.1.11 甲酸（HCOOH，CAS号：64-18-6）：分析纯。5.1.12 硼酸（H3BO3，CAS号：11113-50-1）：分析纯。5.1.13 十水合四硼酸钠（Na2B4O710H2O，CAS号：1303-96-4）：分析纯。5.1.14 水（H2O，CAS号：7732-18-5）：为符合GB/T 6682规定的一级水。溶液配制 5.2.1 6 mol/L盐酸溶液：取50 mL 盐酸（见5.1.3），用水溶解并定容至 100 mL。5.2.2 0.1 mol/L盐酸溶液：取1.67 mL盐酸（见 5.2.1），用水溶解并定容至 100 mL。5.2.3 0.1 mol/L氢氧化钠溶液：称取2.00 g氢氧化钠（见5.1.4），用水溶解并定容至 500 mL。5.2.4 0.01 mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.8）：称取 0.12 g磷酸二氢钠（见 5.1.5），加水溶解并稀释至100 mL，用0.1 moL/L 的氢氧化钠（见5.2.3）调pH至 7.8。5.2.5 0.1 mol/L硼酸钠缓冲液（pH 10.2）：称取 0.49 g 硼酸（见5.1.12）和 0.19 g十水合四硼酸钠（见 5.1.13），用水溶解并定容至100 mL，用 0.1 moL/L氢氧化钠溶液（见 5.2.3）调 pH至 10.2。5.2.6 2 mol/L 硼氢化钠溶液：称取 7.57 g 硼氢化钠（见 5.1.6），用 0.1 mol/L 氢氧化钠溶液（见5.2.3）溶解并定容至100 mL。5.2.7 衍生化试剂：取 80 mg 邻苯二甲醛（见 5.1.7），加入 7.0 mL 0.1 mol/L 硼酸钠缓冲溶液（见5.2.5）和 125 L 3-巯基丙酸（见5.1.8）和 1 mL乙腈（见5.1.10），使其完全溶解，混匀，于4 下保存，有效期为3 个月。5.2.8 丙酮-三氯甲烷溶液（3+1，体积比）：取 300 mL丙酮（见5.1.2）和100 mL三氯甲烷（见 5.1.1），混匀。5.2.9 水-乙腈-甲醇溶液（10+45+45，体积比）：取 450 mL乙腈（见 5.1.10）、450 mL甲醇（见 5.1.9）和 100 mL水，混匀。5.2.10 甲醇-0.1%甲酸水溶液：取 500 mL 甲醇（见5.1.9），加入 0.5 mL 甲酸（见 5.1.11），混匀。标准品 羧甲基赖氨酸标准品（CAS号：5746-04-3），纯度98%。标准品的配制 5.4.1 羧甲基赖氨酸标准储备溶液（1000 mg/L）：准确称取适量羧甲基赖氨酸标准品（精确至 0.1 mg）至棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，混匀。将溶液转至棕色玻璃容器中，-18 下保存，有效期为 6个月。5.4.2 羧甲基赖氨酸标准中间溶液（1.0 mg/L）：准确量取羧甲基赖氨酸标准储备溶液 0.1 mL 于 100 mL棕色容量瓶中，用0.1 mol/L盐酸溶液（见5.2.2）稀释并定容至 100 mL，混匀。将溶液转至棕色玻璃容器中，4 下保存，现配现用。材料 5.5.1 固相萃取柱，C18填料，容积6 mL，填充物 500 mg。5.5.2 微孔滤膜，有机系，孔径0.2 m。6 仪器与设备 高效液相色谱仪：配荧光检测器。分析天平：感量 0.01 mg和0.01 g。DB42/T 22422024 3 离心机：转速不低于5000 r/min。固相萃取装置。氮吹仪。涡旋震荡器。烘箱（可控温）。7 样品制备与保存 样品制备按附录A的规定执行，符合GB/T 30891的要求，制备后的样品于-18 下保存。8 测定步骤 样品前处理 8.1.1 脱脂 称取2 g（精确至0.01 g）试样置于50 mL离心管中，加入20 mL丙酮-三氯甲烷溶液（见5.2.8），充分混匀，以5000 r/min离心5 min，弃去上清液；再次加入20 mL丙酮-三氯甲烷溶液（见5.2.8），重复一次，得蛋白沉淀。8.1.2 硼氢化钠还原 在蛋白沉淀中加入1.6 mL硼酸钠缓冲液（见5.2.5）、400 L硼氢化钠溶液（见5.2.6），静置8 h。8.1.3 水解 将还原后的样品溶液转至安瓿瓶中，加入8 mL盐酸溶液（见5.2.2），氮气保护下密封，于110 烘箱中水解24 h。8.1.4 净化 冷却后取出水解液，用0.1 mol/L氢氧化钠溶液（见5.2.3）将pH调至中性；依次用5 mL甲醇（见5.1.9）和水依次通过固相萃取柱，量取5 mL水解液，以1.0 mL/min的流速通过固相萃取柱（见5.5.1），再用5 mL水去除杂质，挤干小柱后用5 mL甲醇-0.1%甲酸水溶液（见5.2.10）洗脱，收集洗脱液至刻度离心管中，氮吹至干后用1 mL 0.1 mol/L盐酸溶液（见5.2.2）复溶，待衍生。8.1.5 衍生化 量取200 L上述溶液，加入500 L硼酸钠缓冲液（见5.2.5），混匀，再加入20 L衍生化试剂（见5.2.7），涡旋2 min，取上清液经0.22 m微孔滤膜（5.5.2）过滤后，待测。标准工作溶液的制备 量取羧甲基赖氨酸标准中间溶液（1.0 mg/L）和标准储备溶液（1000 mg/L），用盐酸溶液（见5.2.2）稀释，配成浓度为0.01 mg/L、0.05 mg/L、0.1 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L、5.0 mg/L、10 mg/L系列标准工作溶液，各取200L上述系列溶液，其余步骤同“8.1.5”。仪器参考条件 8.3.1 色谱柱：C18 柱，4.6 mm 250 mm,粒径 5.0 m；或性能相当者。