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I C S 1 1.0 2 0C 0 5DB36江 西 省 地 方 标 准D B 3 6/T 1 9 6 4 2 0 2 4新 型 冠 状 病 毒 基 因 溯 源 技 术 规 范G e n e t i c t r a c e a b i l i t y t e c h n i c a l s p e c i f i c a t i o n f o r S A R S-C o V-22 0 2 4-0 5-2 3 发 布 2 0 2 4-1 1-0 1 实 施江 西 省 市 场 监 督 管 理 局发 布D B 3 6/T 1 9 6 4 2 0 2 4I目 次前 言.I I1 范 围.32 规 范 性 引 用 文 件.33 术 语 和 定 义.34 样 本 采 集.35 样 本 运 输 与 管 理.46 全 基 因 组 测 序.57 序 列 生 成.68 结 果 解 读 与 溯 源.6参 考 文 献.7D B 3 6/T 1 9 6 4 2 0 2 4I I前 言本 文 件 按 照 G B/T 1.1-2 0 2 0 标 准 化 工 作 导 则 第 1 部 分：标 准 化 文 件 的 结 构 和 起 草 规 则 的 规 定 起草。请 注 意 本 文 件 的 某 些 内 容 可 能 涉 及 专 利。本 文 件 的 发 布 机 构 不 承 担 识 别 专 利 的 责 任。本 文 件 由 江 西 省 卫 生 健 康 委 员 会 提 出。本 文 件 由 江 西 省 卫 生 健 康 标 准 化 技 术 委 员 会（J X/T C 0 3 7）归 口。本 文 件 起 草 单 位：江 西 省 疾 病 预 防 控 制 中 心。本 文 件 主 要 起 草 人：施 勇、李 健 雄、刘 师 文、肖 芳、徐 刚、冉 鑫、肖 大 瑾、周 珺、张 艳 妮、刘 晓 庆、吴 杨 博 文、王 倩、邱 伟 华、熊 英。D B 3 6/T 1 9 6 4 2 0 2 43新 型 冠 状 病 毒 基 因 溯 源 技 术 规 范1 范 围本 文 件 规 定 了 新 型 冠 状 病 毒 基 因 溯 源 的 样 本 采 集、样 本 运 输 与 管 理、全 基 因 组 测 序、序 列 生 成、结果 解 读 与 溯 源 等 内 容。本 文 件 适 用 于 承 担 新 型 冠 状 病 毒 基 因 溯 源 相 关 工 作 的 机 构 开 展 基 因 溯 源 工 作。2 规 范 性 引 用 文 件下 列 文 件 中 的 内 容 通 过 文 中 的 规 范 性 引 用 而 构 成 本 文 件 必 不 可 少 的 条 款。凡 是 注 日 期 的 引 用 文 件，仅 所 注 日 期 的 版 本 适 用 于 本 文 件。凡 是 不 注 日 期 的 引 用 文 件，其 最 新 版 本（包 括 所 有 的 修 改 单）适 用 于本 文 件。G B 1 9 4 8 9 实 验 室 生 物 安 全 通 用 要 求W S 2 3 3 病 原 微 生 物 实 验 室 生 物 安 全 通 用 准 则W S/T 7 7 6 农 贸(集 贸)市 场 新 型 冠 状 病 毒 环 境 监 测 技 术 规 范关 于 加 强 高 致 病 性 病 原 微 生 物 菌（毒）种 或 样 本 运 输 管 理 的 通 知 赣 卫 科 教 发 2 0 0 9 1 2 号3 术 语 和 定 义下 列 术 语 和 定 义 适 用 于 本 文 件。3.1新 型 冠 状 病 毒 S A R S-C o V-2引 起 新 型 冠 状 病 毒 感 染 的 病 原 体,为 冠 状 病 毒 属 的 一 个 种。3.2全 基 因 组 测 序 w h o l e g e n o m e s e q u e n c i n g对 生 物 样 本 整 个 基 因 组 序 列 进 行 测 定，获 得 完 整 的 基 因 组 信 息。3.3基 因 溯 源 g e n e t i c t r a c e a b i l i t y利 用 生 物 信 息 学 的 分 析 手 段 对 生 物 样 本 的 基 因 组 序 列 进 行 进 化 分 析，获 得 该 生 物 样 本 的 系 统 进 化 关系。4 样 本 采 集D B 3 6/T 1 9 6 4 2 0 2 444.1 样 本 选 取 原 则结 合 流 行 病 学 调 查 信 息 和 病 例 传 播 链 关 系，应 选 择 核 酸 检 测 结 果 C t 值 3 2 且 符 合 以 下 条 件 之 一 的 样本 优 先 开 展 测 序：a)聚 集 性 疫 情 的 首 代 病 例 及 流 行 病 学 关 联 的 关 键 病 例；b)重 症 和 死 亡 病 例；c)6 5 岁 以 上 年 龄 组 病 例 和 免 疫 功 能 低 下 人 群；d)无 基 础 性 疾 病 的 1 6 6 0 岁 人 群 出 现 严 重 疾 病 的 病 例；e)新 型 冠 状 病 毒 感 染 后 临 床 特 征、流 行 特 征 发 生 异 常 变 化 的 典 型 病 例；f)输 入 性 病 例、物 品 及 相 关 环 境 阳 性 样 本。4.2 样 本 类 型4.2.1 病 例 应 采 集 急 性 期 呼 吸 道 样 本，包 括 上 呼 吸 道 样 本（鼻 咽 拭 子、口 咽 拭 子 等）或 下 呼 吸 道 样 本（深 咳 痰 液、肺 泡 灌 洗 液、支 气 管 灌 洗 液、呼 吸 道 吸 取 物 等），重 症 病 例 宜 优 先 采 集 下 呼 吸 道 样 本。4.2.2 环 境 样 本 应 采 集 物 体 表 面 样 本 或 污 水 样 本。4.3 采 集 方 法 及 要 求4.3.1 病 例 样 本 采 集 可 参 照 江 西 省 疾 控 机 构 新 型 冠 状 病 毒 核 酸 检 测 工 作 手 册 第 二 版 的 相 关 要 求 进行。4.3.2 同 一 病 例 应 同 时 采 集 2 份 鼻 咽 拭 子 或 口 咽 拭 子 放 置 在 1 个 釆 样 管 内，以 提 高 病 毒 载 量 用 于 病 毒基 因 组 测 序。4.3.3 环 境 样 本 采 集 可 参 照 W S/T 7 7 6 的 相 关 要 求 进 行。4.3.4 宜 采 用 非 灭 活 病 毒 采 样 管 进 行 采 样。4.3.5 采 样 管 应 包 装 完 好，并 在 有 效 期 内。5 样 本 运 输 与 管 理5.1 运 输 要 求5.1.1 非 灭 活 病 毒 采 样 管 采 集 的 样 本 属 于 A 类 感 染 性 物 质，联 合 国 编 号 为 U N 2 8 1 4，包 装 参 照 世 界 卫 生组 织 感 染 性 物 质 运 输 规 章 指 导 的 P I 6 2 0 分 类 包 装 要 求。5.1.2 环 境 样 本 属 于 B 类 感 染 性 物 质，联 合 国 编 号 为 U N 3 3 7 3，包 装 参 照 世 界 卫 生 组 织 感 染 性 物 质 运输 规 章 指 导 的 P I 6 5 0 分 类 包 装 要 求。5.1.3 灭 活 病 毒 采 样 管 采 集 的 样 本 参 照 关 于 进 一 步 做 好 新 冠 病 毒 实 验 室 生 物 安 全 管 理 工 作 的 通 知 的 要 求，按 照 非 感 染 性 物 质 管 理。5.1.4 新 型 冠 状 病 毒 潜 在 感 染 性 物 质 运 输 应 按 照 关 于 加 强 高 致 病 性 病 原 微 生 物 菌（毒）种 或 样 本 运输 管 理 的 通 知 要 求，取 得 准 运 证 书 后，方 可 运 输。5.2 样 本 管 理5.2.1 新 型 冠 状 病 毒 样 本 检 测 前 应 专 人 集 中 管 理，准 确 记 录 样 本 的 来 源、种 类、数 量，编 号 登 记、建立 台 账，采 取 有 效 措 施 确 保 样 本 的 安 全，严 防 发 生 误 用、恶 意 使 用、被 盗、被 抢、丢 失、泄 露 等 事 件。5.2.2 样 本 应 尽 快 进 行 检 测，2 4 h 内 检 测 的 样 本 可 置 于 2 8 保 存；2 4 h 内 无 法 检 测 的 样 本 则 应 置于-7 0 或 以 下 保 存(如 无-7 0 保 存 条 件，则 于 2 8 冰 箱 暂 存，最 长 不 超 过 7 2 h)。D B 3 6/T 1 9 6 4 2 0 2 456 全 基 因 组 测 序6.1 实 验 室 生 物 安 全 及 个 人 防 护6.1.1 实 验 室 应 依 据 G B 1 9 4 8 9 和 W S 2 3 3 管 理 要 求，确 保 实 验 室 生 物 安 全 和 运 行 有 效 性。6.1.2 实 验 室 人 员 应 按 照 W S 2 3 3 的 要 求，根 据 所 操 作 感 染 性 物 质 的 防 护 等 级，选 择 相 适 应 的 防 护 装备 进 行 防 护。6.1.3 可 参 照 关 于 进 一 步 做 好 新 冠 病 毒 实 验 室 生 物 安 全 管 理 工 作 的 通 知 文 件 的 要 求，新 型 冠 状 病毒 培 养、动 物 感 染 实 验 应 当 在 生 物 安 全 三 级 及 以 上 实 验 室 开 展；未 经 培 养 的 感 染 性 物 质、灭 活 物 质 的 操作，应 当 在 生 物 安 全 二 级 及 以 上 实 验 室 进 行，其 中 未 经 9 5 加 热 1 5 m i n 灭 活 或 固 定 的 人 体 和 动 物 组 织样 本 的 操 作 应 当 在 三 级 及 以 上 实 验 室 开 展；无 感 染 性 物 质 的 操 作 可 以 在 生 物 安 全 一 级 实 验 室 进 行。6.2 实 验 准 备6.2.1 设 备设 备 应 包 括 但 不 限 于 核 酸 提 取 仪、P C R 扩 增 仪、核 酸 定 量 仪、高 通 量 测 序 仪 及 相 应 的 辅 助 设 备，设备 应 校 准 合 格，并 定 期 维 护。6.2.2 试 剂试 剂 应 包 括 但 不 限 于 核 酸 提 取 试 剂 盒、核 酸 定 量 试 剂 盒、新 型 冠 状 病 毒 全 基 因 组 捕 获 试 剂 盒、核 酸纯 化 磁 珠、文 库 制 备 试 剂 盒、高 通 量 测 序 试 剂 盒，无 水 乙 醇 等，试 剂 应 在 有 效 期 内 使 用。6.2.3 耗 材耗 材 应 包 括 但 不 限 于 微 量 移 液 器、不 同 规 格 滤 芯 吸 头、磁 力 架、1.5 m L E P 管、0.2 m L P C R 管、9 6孔 P C R 板 等，耗 材 应 在 有 效 期 内 使 用。6.3 基 因 测 序6.3.1 核 酸 提 取病 毒 R N A 提 取 宜 使 用 核 酸 提 取 试 剂 盒，根 据 试 剂 盒 说 明 书 提 取 核 酸。6.3.2 靶 向 扩 增应 采 用 新 型 冠 状 病 毒 全 基 因 组 捕 获 试 剂 盒，并 根 据 试 剂 盒 说 明 书 对 新 型 冠 状 病 毒 核 酸 进 行 靶 向 扩增。6.3.3 扩 增 产 物 的 纯 化应 使 用 核 酸 纯 化 磁 珠 对 扩 增 产 物 进 行 纯 化。6.3.4 纯 化 产 物 的 定 量应 使 用 核 酸 定 量 试 剂 盒 对 纯 化 产 物 进 行 核 酸 定 量。6.3.5 文 库 构 建应 根 据 使 用 的 高 通 量 测 序 仪 选 择 相 匹 配 的 文 库 制 备 试 剂 盒 进 行 文 库 制 备。D B 3 6/T 1 9 6 4 2 0 2 466.3.6 上 机 测 序根 据 高 通 量 测 序 试 剂 盒 和 高 通 量 测 序 仪 操 作 说 明 完 成 试 剂 装 载，设 置 测 序 参 数 进 行 测 序。7 序 列 生 成7.1 应 去 除 测 序 数 据 中 的 P C R 引 物 序 列、接 头（a d a p t e r）和 低 质 量 的 测 序 数 据，引 物 序 列 按 照 最 大 引物 长 度 3 0 b p 进 行 剪 切（t r i m)。7.2 应 对 下 机 数 据 进 行 质 量 控 制（Q C）分 析，判 断 测 序 质 量 是 否 达 到 仪 器 设 备 的 Q C 值 要 求。7.3 应 以 S A R S-C o V-2 参 考 基 因 组(G e n e B a n k 序 列 获 得 号：N C _ 0 4 5 5 1 2)为 模 板 进 行 序 列 拼 接，拼 接之 后 对 测 序 覆 盖 度 和 测 序 深 度 进 行 分 析，测 序 覆 盖 度 应 9 6%，测 序 深 度 应 1 0 0，最 终 生 成 一 致 性(c o n s e n s u s)序 列，即 为 待 溯 源 样 本 的 全 基 因 组 序 列。8 结 果 解 读 与 溯 源8.1 应 将 待 溯 源 样 本 的 全 基 因 组 序 列 同 S A R S-C o V-2 参 考 基 因 组(G e n e B a n k 序 列 获 得 号：N C _ 0 4 5 5 1 2)进 行 比 对，分 析 出 变 异 位 点。8.2 将 待 溯 源 样 本 的 全 基 因 组 序 列 同 数 据 库 中 的 全 基 因 组 序 列 数 据 进 行 比 对。8.3 利 用 生 物 信 息 学 分 析 工 具 对 序 列 进 行 进 化 分 析，获 得 该 序 列 的 系 统 进 化 关 系。8.4 根 据 序 列 进 化 分 析 结 果，结 合 流 行 病 学 调 查 信 息，对 该 待 溯 源 样 本 进 行 综 合 分 析 判 断，分 析 引 起疫 情 的 病 毒 来 源，得 出 溯 源 结 论。D B 3 6/T 1 9 6 4 2 0 2 47参 考 文 献 1 感 染 性 物 质 运 输 规 章 指 导（世 界 卫 生 组 织 W H O/C D S/C S R/L Y O/2 0 0 5.2 2）2 关 于 进 一 步 做 好 新 冠 病 毒 实 验 室 生 物 安 全 管 理 工 作 的 通 知（国 卫 办 科 教 函 2 0 2 3 1 3 号）3 江 西 省 疾 控 机 构 新 型 冠 状 病 毒 核 酸 检 测 工 作 手 册（第 二 版）（江 西 省 疾 病 预 防 控 制 中 心 2 0 2 0)_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _
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