羊多杀性巴氏杆菌病诊断技术DB15／T 3441—2024.pdf

ICS 65.020.30 CCS B 41 15 内蒙古自治区地方标准 DB15/T 3441 2024 羊多杀性 巴 氏杆菌 病诊断技 术 Diagnostic techniques for pasteurella multocida in sheep 2024-05-31 发布 2024-07-01 实施 内蒙古自 治区市 场 监督管理 局 发 布 DB15/T 3441 2024 I 前 言 本文件 按照GB/T 1.1 2020 标 准化 工作 导则 第1 部分：标准 化文 件的 结构 和起草 规则 的 规 定起草。本文件 由内 蒙古 自治 区畜 牧业标 准化 技术 委员 会（SAM/TC 19）归口。本文件 主要 起草 单位：内 蒙古自 治区 农牧 业科 学院、内蒙 古杜 美牧 业生 物科 技有限 公司。本文件 主要 起草 人：王娜、戴伶 俐、白 帆、张月 梅、杨斌、宋越、张帆、李 慧、达来宝 力格、刘 威、钱琳娜、赵 世华、刘 学文、刘敏、张 英 赵俊 利、菅 瑞珍、董少 华。DB15/T 3441 2024 1 羊多杀性 巴氏杆 菌病诊断 技术 1 范围 本文件 规定 了羊 多杀 性巴 氏杆菌 病的 诊断 技术。本文件 适用 于羊 多杀 性巴 氏杆菌 病的 诊断。2 规范性 引用 文件 下列文 件中 的内 容通 过文 中的规 范性 引用 而构 成本 文件必 不可 少的 条款。其 中，注日 期的 引用 文件，仅该日 期对 应的 版本 适用 于本文 件；不注 日期 的引 用文件，其 最新 版本（包 括所有 的修 改单）适 用 于 本文件。GB/T 4789.28 食品 安全 国家标 准 食品 微生 物学 检 验培养 基和 试剂 的质 量要 求 GB/T 6682 分 析实 验室 用 水规格 和试 验方 法 3 术语和 定义 下列术 语和 定义 适用 于本 文件。多杀性 巴氏 杆菌 pasteurella multocida 属于巴 氏杆 菌科，巴 氏杆 菌属，革兰 氏阴 性球 杆菌 或短杆 状菌，两 端钝 圆，无鞭毛，无 芽孢，有荚膜。根据 荚膜 抗原 可分 为 A、B、D、E、F 5 种 血 清型，种 荚膜 血清 型的 基因分 别 为hyaD-hyaC、bcbD、dcbF、ecbJ、fcbD。羊多杀 性巴 氏杆 菌病 pasteurella multocida in sheep 由多杀 性巴 氏杆 菌引 起的 一种以 败血 和肺 炎为 主要 特征的 细菌 性传 染病。聚合酶 链式 反应 polymerase chain reaction 一种级 联反 复循 环 的 DNA 合成反 应过 程。一般 由三 个步骤 组成：模 板 DNA 的 热变性，特 异性 引物与模 板DNA 的结 合及 引物 延长 新 DNA 链的 合成。4 流行病 学 易感动 物 绵羊山 羊均 可发 病，绵羊 比山羊 易感，羔 羊、幼龄 羊比成 年羊 易感。山 羊散 发，绵 羊群 发。DB15/T 3441 2024 2 传染源 患病羊 和带 菌羊 是主 要传 染源。传播途 径 该病主 要通 过消 化道、呼 吸道感 染，也可 通过 吸血 昆虫、皮肤、黏膜、伤口 感染健 康羊。健 康带 菌羊在受 寒、长途 运输、饲 养管理 不当 等情 况导 致抵 抗力降 低时，可 发生 内源 性感染，出 现临 床症 状。发病季 节 一年四 季均 可发 病，气候 寒冷、闷热 潮湿 的季 节多 发，呈 散发 或地 方性 流行。5 诊断 临床诊 断 5.1.1 临床症 状及 病理 变化 5.1.1.1 最急性 型症 状 羊突然 发病，呈 高热、呼 吸困难、抽 搐等 症状，数 分钟或 数小 时内 死亡，难 以看到 特征 性病 变。5.1.1.2 急性型 症状 病羊精 神沉 郁，食欲 废绝，体温 升高 至41 42。呼 吸急 促、咳嗽、鼻 孔出血；眼 结膜 潮红，有黏性 分泌 物；初期 便秘，后期 腹泻，有时 粪便 为 血水，颈部、胸下 部位 发 生水肿；病 羊常 在严 重腹 泻后虚脱 而死；病 程2 d 5 d。解剖可 见下 颌淋 巴结 水肿、出 血，气 管内 有泡 沫淡 红 色液体，心包 膜上 存在 纤 维素絮 片且 含有 包积液，胸 腔内 含有 大量 浆液 性纤维 素性 渗出 液，肺脏 发生淤 血、出血，间质 变 宽，切 面有 大量 的浆 液，组织中存 在不 同大 小的 坏死 灶，肺 门淋 巴结 发生 肿胀、出血。5.1.1.3 慢性型 症状 病羊消 瘦，食欲 减退，流 黏脓性 鼻液；咳 嗽；呼 吸 困难；颈胸 部有 时发 生水 肿；病 羊腹 泻，粪 便恶臭，机 体虚 弱，体温 下降，四肢 厥冷。解剖可 见皮 下有 液体 浸润 和小出 血点；胸 腔内 有黄 色渗出 物，肺淤 血，存在 小出血 及肝 变区，偶 见黄豆至 胡桃 大的 化脓 灶；胃肠道 有出 血性 炎症；其 他器官 水肿 和淤 血。病期 较长者 皮下 胶样 浸润，常 有纤维素 性胸 膜肺 炎，肝有 坏死灶。实验室 诊断 5.2.1 试剂和 材料 生理盐 水、细菌 微量 生化 反应管 及指 示剂、Tap酶、TAE电 泳缓 冲液、DNA Marker 等。除另有 规定，所 用试 剂均 为分析 纯，水为 符合GB/T 6682 的 蒸馏 水。各种培 养基 的制 备方 法按 照附录A要求。5.2.2 仪器和 设备 DB15/T 3441 2024 3 匀质 器和 匀质 杯、天 平、培养箱、恒 温水 浴锅、核 酸电泳 仪、PCR 仪、高 压蒸 汽灭菌 锅、凝胶 成像系统、光学 显微 镜、恒温 摇床。5.2.3 样品采 集 5.2.3.1 鼻拭子 的采 集 对活羊 采取 鼻腔 拭子。采 样人员 将棉 拭子 轻轻 插入 鼻腔，与 鼻中隔 平行 方向 插入约2 cm 5 cm，轻旋转棉 拭子 旋转23 圈，当羊出 现喷 嚏反 射后，轻 轻抽出 棉拭 子。在2 8 下24 h内 完成 送检 工作。如 样品 不能 及时 送到 实验室，应 置于-20 以 下保存。5.2.3.2 组织样 品的 采集 对病死 羊主 要采 集其 气管 和肺脏 等组 织，置于 无菌 密封袋 或采 样杯；在2 8 下24 h 内完 成送检工 作。如样 品不 能及 时送到 实验 室，应置 于-20 以 下保 存。5.2.4 病原检 测 5.2.4.1 涂片镜 检 无菌取 气管、肺 等组 织进 行涂片，按 照GB/T 4789.28 所述 的方 法进 行革 兰氏 染 色。多 杀性 巴氏 杆菌为革兰 氏阴 性菌，菌 体呈 球杆状 或短 杆状，两 端钝 圆。瑞 士染 色或 美蓝 染色 呈典型 的两 极着 色。5.2.4.2 细菌的 分离 5.2.4.2.1 鼻腔拭 子的 分离 将鼻腔 拭子 样品 置于5 mL 5%马血 清的 胰蛋 白胨 大豆 肉汤中，37 培 养16 h 20 h 后，划 线接 种于含5%马血 清的 胰蛋 白胨 大豆琼 脂平 板或 普通 琼脂 绵羊血 平板。5.2.4.2.2 组织样 品的 分离 用 经 火 焰灭 菌 并冷 却 的接种 环 蘸 取 病 料 内部 组 织后 划 线 接 种于 含5%马 血 清的胰 蛋 白 胨大 豆 琼脂 平板或普 通琼 脂绵 羊血 平板,按照附 录A 的要 求，于37 培养16 h 20 h 后 观察。5.2.5 初步鉴 定 羊多杀 性巴 氏杆 菌37 培养16 h后，在 普通 琼脂 绵 羊血平 板和 含5%马血 清的 胰蛋白 胨大 豆琼 脂平板(TSA)上 形成 圆形 微凸 起、表面 光滑、边缘 整齐、半透明 的菌 落，直径 约0.3 mm 1.2 mm，菌 株 溶血。该 菌为 革兰 氏阴 性杆 菌，无 芽胞，有 荚膜。菌落生 长特 征、革兰 氏染 色、菌 体形 态符 合者，可 初步确 定为 羊多 杀性 巴氏 杆菌。5.2.6 生化鉴 定 挑取 纯 培养 物的 单菌 落 接 种至细 菌微 量生 化反 应管，置于37 恒 温培 养箱 中，24 h 后 观察 结果。羊多杀 性巴 氏杆 菌发 酵 木 糖、海藻 糖、甘露 醇、葡 萄 糖，鸟氨 酸脱 羧酶、吲 哚试 验为阳 性，脲 酶、乳酶、甲基红、氧 化酶、VP 试验 为阴性。5.2.7 羊多杀 性巴 氏杆 菌 PCR 检测 5.2.7.1 DNA 提取 DB15/T 3441 2024 4 培养产 物取1 mL 于4，12000 rpm 离心1 min，弃 上 清，沉 淀用 细菌 基因 组DNA 提取试 剂盒 提取 基因组DNA。5.2.7.2 引物序 列 引物序 列见 附录B。5.2.7.3 PCR 反 应体 系 总体积25 L，其 中2Taq Mix 12.5 L，上下 游 引物(10 mol/L)各1 L，羊多 杀性 巴氏杆菌DNA模板1.0 L，去 离子水9.5 L。5.2.7.4 PCR 反 应条 件 94 5 min；94 30 s，55 30 s，72 1 min 30 s，30 个循 环；72 延伸7 min。若 不立即电 泳将PCR 产物 置于-20 保 存。5.2.7.5 PCR 反 应产 物检 测 将PCR 反应 产物 于1.5%琼 脂 糖凝胶 进行 电泳，电 压为120 V，时间30 min。5.2.7.6 电泳结 果 16S rRNA PCR 产 物凝 胶电 泳成像 结果 显示 扩增 条带 在 1500 bp 处，无 杂带，且阴性 对照 未出 现 特异性条 带，可 将PCR 产物 测序，测序 结果 与标 准序 列进行 比对。KMT1 基 因扩 增产 物为 PCR 产物 460 bp，对 KMT1 基因 PCR 阳性 的样 品用 上述 方法进 行 5 个荚 膜型鉴定。6 结果判 定 符合5.1，判定 为羊 多杀 性 巴 氏杆 菌疑 似病 例。符合5.1、5.2.5、5.2.6、5.2.7，判 定为 羊多 杀性 巴 氏杆菌 确诊 病例。7 废弃物 处理 和防 止污 染的 措施 依据 病死 及病 害动 物无 害化处 理技 术规 范 及 病原微 生物 实验 室生 物安 全管理 条例 对 废弃 物进行无 害化 处理。DB15/T 3441 2024 5 A A 附录A（规范 性）培养基 的配 制方 法 A.1 普通琼 脂绵 羊血 平板 A.1.1 成份 成份见 表A.1。表A.1 成分 A.1.2 制法 除无菌 绵羊 血外，其 余成 份混合，加 热溶 解，调 pH至7.6 分装，115 灭菌15 min，冷 却至50 5 加入5%无 菌脱 纤维 绵羊血 倾注 灭菌 平板。A.2 5%马血 清的 胰蛋 白胨 大豆 琼脂培 养基 A.2.1 成份 成份见 表A.2。表A.2 成分 A.2.2 制法 取上述 成分 除琼 脂，其余 成份混 合，微热 溶解，调 节pH值为7.3 0.2，加入 琼脂，加热 融化 后，分装，灭 菌，冷却 至50 5 添加50 mL 的马 血清，混匀，倾注 至无 菌平 皿。A.3 5%马血 清的 胰蛋 白胨 大豆 肉汤 A.3.1 成份 成份见 表A.3。牛肉膏 3.0 g 蛋白胨 10.0 g 氯化钠 5.0 g 磷酸二氢钾 1.0 g 琼脂 15.0 g 蒸馏水 1000.0 mL 脱纤维无菌绵羊血 50.0 mL 胰酪蛋白胨 15.0 g 大豆蛋白胨 5.0 g 氯化钠 5.0 g 琼脂 15.0 g 蒸馏水 1000.0 mL DB15/T 3441 2024 6 表A.3 成分 A.4 制法 将以上 成份 溶解 于1000 mL 蒸馏水 并调 整pH 值为7.3 0.2，121 高 压蒸 汽灭 菌15 min，冷 却至50 5 添加50 mL 的 马血 清，混匀，倾 注至 无菌 平皿。胰酪蛋白胨 17.0 g 大豆蛋白胨 3.0 g 氯化钠 5.0 g D-葡萄糖 2.5 g 磷酸氢二钾 2.5 g 蒸馏水 1000.0 mL DB15/T 3441 2024 7 B B 附录B（资料 性）羊多杀 性巴 氏杆 菌 PCR 扩 增引物 序列 羊多杀 性巴 氏杆 菌PCR 扩 增 引物序 列见 表B.1。表B.1 羊多 杀性 巴氏 杆菌PCR 扩 增引物 序列 基因 引物名称 序列(5 3)目的片段/bp 16S rRNA 16S rRNA-F ACGCGTCGACAGAGTTTGATCCTGGCT 1500 16S rRNA-R CGCGGATCCGCTACCTTGTTACGACTT KMT1 KMT1-F ATCCGCTATTTACCCAGTGG 460 KMT1R GCTGTAAACGAACTCGCCAC hyaD-hyaC hyaD-F TGCCAAAATCGCAGTCAG 1044 hyaD-R TTGCCATCATTGTCAGTG bcbD bcbD-F CATTTATCCAAGCTCCACC 760 bcbD-R GCCCGAGAGTTTCAATCC dcbF dcbF-F TACAAAAGAAAGACTAGGAGCCC 657 dcbF-R CATCTACCCACTCAACCATATCAG ecbJ ecbJ-F TCCGCAGAAAATTATTGACTC 511 ecbJ-R GCTTGCTGCTTGATTTTGTC fcbD FcbD-F AATCGGAGAACGCAGAAATCAG 811 FcbD-R TTCCGCCGTCAATTACTCTG DB15/T 3441 2024 8 参考文 献 1 中华人 民共 和国 农业 部.病 死及病 害动 物无 害化 处理 技术规 范.2017 年.2 中华人 民共 和国 国务 院.病 原微生 物实 验室 生物 安全 管理条 例.2018 年.