青稞品种鉴定技术规程 SNP分子标记法DB63／T 2288-2024.pdf

ICS 65.020.01 CCS B 21 DB63 青 海 地 方 标 准 DB 63/T 22882024 青稞品种鉴定技术规程 SNP分子标记法 2024-6-19发布 2024-7-25实施 青海省市场监督管理局 发 布 DB63/T 22882024 I 前 言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由青海省农业农村厅提出并归口。本文件起草单位：中国科学院西北高原生物研究所、青海省农作物种子站、海南州农牧业综合服务中心、青海省乡村产业发展指导中心。本文件主要起草人：王寒冬、沈裕虎、王蕾、徐金青、边海燕、韩文婷、李春桥、薛明珍、王焕强、李俊仁、包天忠、赵璨、王健斌、陈同睿、尤恩、邓超。本文件由青海省农业农村厅监督实施。DB63/T 22882024 1 青稞品种鉴定技术规程 SNP分子标记法 1 范围 本文件规定了青稞（Hordeum valgare L.var.nudum Hook.f.）品种鉴定SNP分子标记方法的术语和定义、缩略语、仪器设备及试剂、溶液配制、KASP引物信息、引物选择、操作程序、数据记录与统计、结果应用等技术要求。本文件适用于青稞品种及种质资源的鉴定。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 3543.2 农作物种子检验规程 扦样 GB/T 3543.4 农作物种子检验规程 发芽试验 GB/T 3543.5 农作物种子检验规程 真实性和品种纯度鉴定 GB 4404.1 粮食作物种子 第1部分：禾谷类 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 19495.3 转基因产品检测 核酸提取纯化方法 GB/T 30988 多酚类植物基因组DNA提取纯化及测试方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 推荐引物 用本文件进行品种及种质资源鉴定时选用的一套SNP引物。3.2 参照品种 具有所用SNP位点上不同等位变异的品种。3.3 送检样品 送到种子检验机构检验的样品。DB63/T 22882024 2 3.4 试验样品 在实验室中从送检样品中分离出来的部分样品，供检验项目使用。4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。DNA：脱氧核糖核酸（DeoxyriboNucleic Acid）KASP：竞争性等位基因特异性PCR（Kompetitive Allele Specific PCR）PCR：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）SNP：单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism）5 仪器设备及试剂 仪器设备及试剂见附录A，所用试剂均为分析纯。本文件所使用的超纯水应符合GB/T 6682的要求。6 溶液配制 见附录B。7 KASP 引物信息 分为、两组。见附录C 8 KASP 引物选择 首先选择附录C中组引物进行扩增。当样品间检测出的差异位点数小于2时，选用附录C中、组所有引物进行扩增。9 操作程序 9.1 样品准备 按照GB/T 3543.5的规定，送检样品质量应符合GB 4404.1 粮食作物种子 第1部分：禾谷类中对大麦种子纯度的要求。试验样品的分样应符合GB/T 3543.2的规定。按照GB/T 3543.4的规定进行发芽，供发芽的籽粒数须大于等于50粒。植株长至三叶一心时，按单株采取叶片进行样品制备。9.2 DNA 样品制备 按照GB/T 19495.3的方法或采用商用的植物基因组DNA提取试剂盒进行DNA的提取。每个送检品种制备的DNA样品数量须大于等于50个单株；单提、单检。试验样品DNA纯度、浓度测试应符合GB/T 30988的规定。9.3 实时荧光定量 PCR 仪 SNP 分型 DB63/T 22882024 3 SNP分型操作流程如下：a)将 2 L DNA 样品编号后分别加到 96 孔 PCR 板上对应编号的反应孔中，每块 PCR 板均须加 2个阴性对照（即用2 L超纯水替代 DNA样品，其余所加试剂完全一致）。每块 PCR板只检测一个送检品种。b)依试验样品量，按照表 1 配制 KASP 基因分型混合液。配制前所有试剂均应涡旋振荡，补足损失的体积。表1 KASP 基因分型混合液 试剂 体积（L）2KASP Master mix 5 Primer_Allele FAM(10 mol/L)0.5 Primer_Allele HEX(10 mol/L)0.5 Primer_Common(10 mol/L)1 超纯水 1 总体积 8 c)使用微量移液器将 9.3 SNP 分型操作流程 2）中的 KASP 基因分型混合液分别加入到 9.3 SNP分型操作流程 1）已加入DNA样品的 PCR板上的反应孔中，每孔加 8 L。d)用荧光透视的膜将PCR 板密封，然后转速3000 rpm，离心时间30 sec。e)KASP反应在实时荧光定量PCR仪上进行，程序设置见表 2。表2 实时荧光定量 PCR 反应程序 步骤 说明 温度 时间 循环数 1 预变性 94 15 min 1 变性 94 20 sec 2 复性/延伸 6155 60 sec（每循环降低 0.6）10 变性 94 20 sec 3 复性/延伸 55 60 sec 26 f)PCR反应结束后，在该仪器上进行荧光数据的读取，读取时程序设置为：温度30，时间 60 sec，循环数 1。g)当数据对应的荧光信号较低，分群较散时，可以增加循环后进行荧光读取，同时保证阴性对照没有被扩增。程序设置如下：94变性 20 sec，57复性/延伸 60 sec，此步骤进行 3个循环。再按照 9.3 SNP分型操作流程 6）进行荧光数据的读取。10 数据记录与统计 样品每个SNP位点的等位变异采用荧光定量PCR仪检出的荧光信号表示。通过读取荧光信号确定试验样品在该位点的等位变异并进行记录和统计。11 结果应用 当送检品种样品间差异位点数大于等于2，则判定为“不同品种”；当送检品种样品间差异位点数等于1，判定为“近似品种”；当送检品种样品间差异位点数等于0，判定为“极近似品种或相同品种”。DB63/T 22882024 4 另外，可将试验结果直接与附录D参照品种SNP碱基类型进行比对，当与参照品种一致时，可以鉴定为某一品种。DB63/T 22882024 5 A A 附 录 A（规范性）主要仪器设备及试剂 A.1 主要仪器设备 实时荧光定量PCR仪、电子恒温不锈钢水浴锅、电子天平（精度0.01 g、0.0001g 各一台）、磁力搅拌机、高速台式离心机、高通量组织研磨仪、微量分光光度计、高压灭菌锅、酸度计、微量移液器、冰箱。A.2 主要试剂 乙二胺四乙酸二纳、三羟甲基氨基甲烷、盐酸、氢氧化钠、氯化钠、十六烷基三甲基溴化铵、-巯基乙醇、Tris-饱和酚、三氯甲烷、异丙醇、无水乙醇、2KASP Master mix、KBD Assay mix、超纯水。DB63/T 22882024 6 B B 附 录 B（规范性）溶液配制 B.1 DNA提取试剂 B.1.1 0.5 mol/L乙二胺四乙酸二纳盐（EDTA）（pH 8.0）溶液 称取9.305 g的EDTA-Na22H2O，加40 mL超纯水，充分溶解，用0.8 g1.1 g NaOH固体调节pH至8.0，定容至50 ml。在103.4 kPa（121）条件下灭菌20 min，室温保存。B.1.2 1 mol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸（Tris-HCl）（pH 8.0）溶液 称取6.06 g的Tris，加40 ml的超纯水，充分溶解。用1.8 mL2.2 mL 的浓HCl（36%38%）调节pH至8.0，定容至50 ml。灭菌温度和时间同B.1.1，室温保存。B.1.3 DNA提取液 依次加入十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）8 g、氯化钠32.7 g、10 mL Tris-HCl溶液（pH 8.0）（见B.1.2）和4 mL EDTA溶液（pH 8.0）（见B.1.1），再加入超纯水，充分溶解后，用超纯水定容至400 mL。灭菌温度和时间同B.1.1，4保存。B.1.4 10倍DNA溶解液 取10 mL 1 mol/L Tris-HCl溶液（pH 8.0）（见B.1.2）和2 mL 0.5 mol/L EDTA溶液（pH 8.0）（见B.1.1），加入超纯水，混合均匀，定容至100 ml。分装后灭菌，灭菌温度和时间同B.1.1，室温保存。DB63/T 22882024 7 C C 附 录 C（规范性）推荐 KASP引物 推荐KASP引物见表C.1 表C.1 推荐 KASP引物 标记 引物组别 染色体 等位变异 KASP 引物序列（53）1H_1 1H A/T Primer_Allele FAM:CTGAGTTTGTGGAAGGAGCTATTTTT Primer_Allele HEX:CTGAGTTTGTGGAAGGAGCTATTTTA Primer_Common:TCAGTAAGAGTGAAATGACCTGCAACAAA 2H_1 2H C/A Primer_Allele FAM:TGTTGCTCCTTCTGCTGCCC Primer_Allele HEX:GTTGTTGCTCCTTCTGCTGCCA Primer_Common:CCACACAAACCTCACTGCTAGTAGTA 3H_1 3H G/A Primer_Allele FAM:CGCAACACCTGGATTCGGTCG Primer_Allele HEX:CGCAACACCTGGATTCGGTCA Primer_Common:CGCTGGCAGCTCCAGGGCAA 4H_1 4H G/T Primer_Allele FAM:GCGTCAGGTTGAGGAGATTCTG Primer_Allele HEX:GGCGTCAGGTTGAGGAGATTCTT Primer_Common:AAGGTTGCCAAGCTCAAAAAGGAGAAATT 5H_1 5H G/A Primer_Allele FAM:CGTCAGCACTGACTGTCCC Primer_Allele HEX:CTCGTCAGCACTGACTGTCCT Primer_Common:CTTGCCTGCATCCATTCATTCAAATACAA 6H_1 6H G/A Primer_Allele FAM:CCAATTCGCCTGATTAAACCAACC Primer_Allele HEX:CTCCAATTCGCCTGATTAAACCAACT Primer_Common:ACAGATCTGGCGGACAGTTATGGAA 7H_1 7H G/A Primer_Allele FAM:AGAAATATTCCAGCCGGCCGAG Primer_Allele HEX:AGAAATATTCCAGCCGGCCGAA Primer_Common:CGGTACTACCGCCAGAGTTCAAAAT 1H_2 1H A/G Primer_Allele FAM:GCGACGCAGCACGACCGA Primer_Allele HEX:GCGACGCAGCACGACCGG Primer_Common:CTGATTCGACGCAGCGCTGGAA 2H_2 2H A/G Primer_Allele FAM:GACAAGGCCAGCGGTGCAGT Primer_Allele HEX:ACAAGGCCAGCGGTGCAGC Primer_Common:TCGTGCACGCCAAGACCTCCAA 3H_2 3H G/A Primer_Allele FAM:CCTCCGGTGGCCGGCG Primer_Allele HEX:GCCTCCGGTGGCCGGCA Primer_Common:GGCCGGATCCAGGCTCCCTT DB63/T 22882024 8 表 C.1 推荐KASP引物（续）标记 引物组别 染色体 等位变异 KASP 引物序列（53）4H_2 4H T/C Primer_Allele FAM:CCACCTCCTTCTCCAGCCGT Primer_Allele HEX:CACCTCCTTCTCCAGCCGC Primer_Common:GGCGGGCCCAAGATGGGCTT 6H_2 6H C/A Primer_Allele FAM:ATTGGACTAATGGAGGAGTCACTTC Primer_Allele HEX:AATTGGACTAATGGAGGAGTCACTTA Primer_Common:TCCAAACTGTTTTGGGGAAATTACTCCTT 7H_2 7H G/A Primer_Allele FAM:GGCGGCACCGACGCCG Primer_Allele HEX:CTGGCGGCACCGACGCCA Primer_Common:GCTAAGCCCCGCCGGCCAT 1H_3 1H C/T Primer_Allele FAM:GCCACCCAACCGTAGCAGC Primer_Allele HEX:CGCCACCCAACCGTAGCAGT Primer_Common:GGTGCCCTAGGGTTTCCCCTTA 2H_3 2H G/T Primer_Allele FAM:GGTGGTCTGATCCTCAAAGGC Primer_Allele HEX:GGGTGGTCTGATCCTCAAAGGA Primer_Common:CCTTCCGTCACAGCCATGAAGTTTA 3H_3 3H C/T Primer_Allele FAM:CATGCCTTGCATAATTTACAAGTTATGC Primer_Allele HEX:ACATGCCTTGCATAATTTACAAGTTATGT Primer_Common:CTCCGAACCAAACACTCTAATCATAACTT 4H_3 4H C/A Primer_Allele FAM:GTAGCGCCACTTGCGTGCTC Primer_Allele HEX:AGTAGCGCCACTTGCGTGCTA Primer_Common:CTTCCTCCTCCCACACCCGTAT 6H_3 6H G/A Primer_Allele FAM:GCACTAAACATCGCACTCGGG Primer_Allele HEX:GTGCACTAAACATCGCACTCGGA Primer_Common:TTAGGCGATTCGTGATCGCAGCTAA 7H_3 7H T/G Primer_Allele FAM:GCCTCAGCCTCCGCCTCA Primer_Allele HEX:GCCTCAGCCTCCGCCTCC Primer_Common:CGGAGGCTGAGGCGGAGCAT 1H_4 1H T/C Primer_Allele FAM:CAAATCTATGTTTGCCGTGTACATTGT Primer_Allele HEX:AAATCTATGTTTGCCGTGTACATTGC Primer_Common:GCTCCTATCACCACAACTGCAAGTA 2H_4 2H C/G Primer_Allele FAM:GCGTTTCGCCAGCGCACAG Primer_Allele HEX:GCGTTTCGCCAGCGCACAC Primer_Common:ATCGACCAATAGATTTGGGGAAACGTTTA 2H_5 2H T/C Primer_Allele FAM:GCGCACCGGTGCGTGCTT Primer_Allele HEX:GCGCACCGGTGCGTGCTC Primer_Common:CCGAAGAGCTCGGCGTCGAA 3H_4 3H C/T Primer_Allele FAM:CAATACCTACCAATGGTATATAGCAAG Primer_Allele HEX:AACAATACCTACCAATGGTATATAGCAAA Primer_Common:GACCTGAAAGCAGTACTAACGATATCTTA DB63/T 22882024 9 表 C.1 推荐KASP引物（续）标记 引物组别 染色体 等位变异 KASP 引物序列（53）4H_4 4H G/A Primer_Allele FAM:CGCTCCGCCATCATCGGC Primer_Allele HEX:GCGCTCCGCCATCATCGGT Primer_Common:CAGGAAGGCGCACCGACACTTA 6H_4 6H T/C Primer_Allele FAM:GGCATTGGCAGCTTCAACACGA Primer_Allele HEX:GCATTGGCAGCTTCAACACGG Primer_Common:TGCTGTCCAGTTTTCAGCTCCTGTT 6H_5 6H C/T Primer_Allele FAM:AGGTAACAACAATGAAGCGAACGAC Primer_Allele HEX:AAGGTAACAACAATGAAGCGAACGAT Primer_Common:CGTCCTCCGCCTCATCGTCAT 6H_6 6H A/G Primer_Allele FAM:TCTTGATGGCGTCGTCCA Primer_Allele HEX:GCTTCTTGATGGCGTCGTCCG Primer_Common:GAAGAAGCGGCCCAAGCAGCTA 7H_4 7H T/A Primer_Allele FAM:GTACCGTCATCCTTGCGGTTGT Primer_Allele HEX:GTACCGTCATCCTTGCGGTTGA Primer_Common:GAAAGTCTTCGCAAAAAGTCCGACGAA 注1：中为标记荧光 DB63/T 22882024 10 D D 附 录 D（资料性）参照品种 SNP 碱基类型 参照品种推荐引物变异位点SNP碱基类型见表D.1 表D.1 参照品种推荐引物变异位点SNP碱基类型 品种名称 1H_1 1H_2 1H_3 1H_4 2H_1 2H_2 2H_3 2H_4 2H_5 3H_1 3H_2 3H_3 3H_4 4H_1 福 8-4 T R C T M A K C T G G T T G 莫多吉 1 号 A R C Y C A K G T G G T T K 门农 1 号 A R C Y C A K G T G G T T K 东青 1 号 T R C Y C A K G T G R T C G 同德系选 8 号 A R C Y C A K C T G G T T K 互青 2 号 A R C T C A K G T G R T T G 北青 1 号 T R C Y C A K S Y G G T T G 北青 4 号 T R C Y M A K C C G R T T G 北青 5 号 T R C Y M A K S T G G T T K 北青 6 号 T R Y Y C A K C C G G T T G 北青 7 号 T R C Y C A K G T G G T C G 北青 8 号 A R C Y M A K G T G G T T K 昆仑 1 号 T R C Y C A K C C G G Y C G 昆仑 2 号 T R C T M A G C C G G C C G 昆仑 3 号 T R C Y C A K C C G R C C G 昆仑 8 号 T R C T C A K C C G G T C K 昆仑 10 号 T R C T C A K C C G G T C G 昆仑 12 号 T A C T M A K C T G G T T G 昆仑 164 T R C Y M A K C C G R T T G 昆仑 13 号 T R C T C A K C T G G T T G 巴青 1 号 A R C Y M A K C T G R Y T G 昆仑 14 T A C T C A G C T G R C T G 昆仑 15 T A C T C A K C T G G T T G DB63/T 22882024 11 表 D.1 参照品种推荐引物变异位点SNP碱基类型（续）品种名称 4H_2 4H_3 4H_4 5H_1 6H_1 6H_2 6H_3 6H_4 6H_5 6H_6 7H_1 7H_2 7H_3 7H_4 福 8-4 C A R G G A G C Y G G G K T 莫多吉 1 号 C A G G R A R C Y G R R G T 门农 1 号 C A G G R A G C Y G R G T T 东青 1 号 C A G G G A G C C G G G G T 同德系选 8 号 C A G G G A R C Y G R G T T 互青 2 号 C A R G G A R C Y G R G K T 北青 1 号 C A G G G A G Y Y R G G T T 北青 4 号 C A G G G A G C C G G R T T 北青 5 号 C A G G G A G C Y G G G K T 北青 6 号 C A G G G A G C Y G R G K T 北青 7 号 C A G G G A G C Y G R G T T 北青 8 号 C A G G R A G Y Y G G R G T 昆仑 1 号 C A R G R A G C Y G G G K T 昆仑 2 号 C A R G G A G C Y G R G G T 昆仑 3 号 C A R G R A R C Y G G G K T 昆仑 8 号 C M G G G A G C Y G G G G T 昆仑 10 号 C A G G G A G C Y G R G K T 昆仑 12 号 C A G G G A R T Y G G G K T 昆仑 164 C A G G G A G C Y G R G K T 昆仑 13 号 C A G G G A R T Y G G G K T 巴青 1 号 C A G G R M G Y Y G R R K T 昆仑 14 C A G G G A G C Y G G G G T 昆仑 15 C A A G G A G Y Y G R G K T 注：M:A/C;K:T/G;Y:T/C;R:A/G;W:A/T;S:G/C _