籽用西葫芦叶片三种病毒RT-PCR检测技术规程DB15／T 3534—2024.pdf

ICS 65.020.01 CCS B 04 15 内蒙古自治区地方标准 DB15/T 3534 2024 籽用西葫 芦叶片三 种病毒 RT-PCR 检测 技术规程 Technical code of practice for RT-PCR detection of three viruses from leaves of seed-used pumpkin(Cucurbita pepo L.)2024-06-28 发布 2024-07-28 实施 内蒙古自 治区市 场 监督管理 局 发 布 DB15/T 3534 2024 I 前 言 本文件 按照GB/T 1.1 2020 标 准化 工作 导则 第1 部分：标准 化文 件的 结构 和起草 规则 的 规 定起草。本文件 由内 蒙古 自治 区农 牧厅提 出。本文件 由内 蒙古 自治 区果 蔬标准 化技 术委 员会（SAM/TC 25）归 口。本文件 起草单 位：内蒙古 农业大 学、内 蒙古 弘昌农 业有限 责任公 司、呼和浩 市农牧 技术推 广中 心。本文件 主要 起草 人：王萍、龙建 国、刘杰 才、陈贵 华、苏 利民、孙 婧、许珂、尚鹏。DB15/T 3534 2024 1 籽用西葫 芦叶片 三种病 毒 RT-PCR 检测技术 规程 1 范围 本文件 规定 了籽 用西 葫芦 叶片三 种病 毒RT-PCR 检测 技术中 涉及 的术 语和 定义、试剂 与材 料、仪器 和设备、对照 设置、样 品采 集、样 品病 毒检 测、结果 分析。本文件适 用于 籽用西 葫芦 叶片中黄 瓜花 叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）、西 瓜花叶 病 毒（Watermelon mosaic virus，WMV）、小西 葫芦 黄化 花叶病 毒（Zucchini yellow mosaic virus，ZYMV）的RT-PCR 检 测。2 规范性 引用 文件 本文件 没有 规范 性引 用文 件。3 术语和 定义 下列术 语和 定义 适用 于本 文件。黄瓜花 叶病 毒 Cucumber mosaic virus 属于雀麦 花叶 病毒科（Bromoviridae）黄瓜 花叶病 毒（Cucumovirus），可以 侵 染1000 多种植 物。主要通 过蚜 虫以 非持 久方 式传播，也是 典型 的种 传 病毒。黄 瓜花 叶病 毒一 般 为系统 侵染 植物，主要 表 现为叶片 斑驳 花叶，叶 肉浅 绿，叶 脉深 绿；严重 时呈 现叶片 皱缩，叶 肉退 化，蕨叶等 症状。西瓜花 叶病 毒 Watermelon mosaic virus 属于马 铃薯Y病 毒科（Potyviridae）马铃 薯Y病 毒属（Potyvirus），在 自然 界 中通过 蚜虫 以非 持久性方式 传播，也 可经 汁液 摩擦接 种传 播。受侵 染的 病株叶 片表 现花 叶、畸形、新生 叶片 扭曲，植 株 生 长受阻，果实 畸形。小西葫 芦黄 化花 叶病 毒 Zucchini yellow mosaic virus 属于马 铃薯Y病 毒科（Potyviridae）马铃 薯Y病 毒属（Potyvirus），可 由多 种 蚜虫以 非持 久性 方式传播，也能 通过 种子 传播。小西 葫芦 黄化 花叶 病毒 表现为 系统 侵染，整 株花 叶、黄 化、叶 片皱 缩、果 实畸形、表面 有泡 状或 者瘤 状突起。4 试剂与 材料 DB15/T 3534 2024 2 试剂 琼脂糖、核 酸染 料、Premix Taq酶、TRIzol 试剂、PCR 产物回 收试 剂盒、TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix 试剂 盒、pMD18-T载 体、大肠 杆菌 感受 态细胞DH5a、DNA 分 子量标准：可以 清楚 区分100 bp 500 bp 的DNA 片段。溶液配 制 4.2.1 10 mol/L 氢 氧化 钠(NaOH)溶液：在160 mL 水中 加 入80.0 g 氢 氧化 钠，溶解 后，冷 却至 室温，再加水 定容 至200 mL。4.2.2 0.5 mol/L 乙二 胺四 乙酸 二 钠(EDTA-Na2)溶液(pH 8.0)：称 取18.6 g 乙二 胺四 乙酸二 钠，加入70 mL 水中，缓 慢滴 加氢 氧化钠 溶液(见 4.3)直至 EDTA-Na2 完 全溶 解，用氢 氧化钠 溶液(见 4.3)调 pH至8.0 加水 定容 至100 mL。在121 条 件下 灭菌 20 min。4.2.3 1 mol/L 三 羟甲 基氨 基甲 烷-盐酸(Tris-HCL)溶液(pH 8.0)：称取 121.1 g 三羟 甲基氨 基甲 烷溶解于800 mL 水 中，用盐 酸 调 pH 至8.0 加 水定 容至1000 mL。在 121 条件 下 灭菌 20 min。4.2.4 TE 缓 冲液(pH 8.0)：分别 量取10 mL 三羟 甲基 氨基 甲烷-盐酸 溶液(见 4.5)和2 mL 乙 二胺 四乙酸二钠 溶液(见4.4)，加 水定容 至 1000 mL。在 121 条 件下 灭菌20 min。4.2.5 50 TAE 缓 冲液：称 取 242.2 g 三羟 甲基 氨基 甲烷(Tris)，先用500 mL 水加热 搅拌溶 解后，加入100 mL 乙二 胺四 乙酸 二 钠溶液(见4.4)，用 冰乙 酸调 pH 至8.0，然 后加 水 定容 至 1000 mL。使用时用水稀 释 成1TAE。4.2.6 加样缓 冲液：称 取 250.0 mg 溴 酚蓝，加 入 10 mL 水，在室 温下 溶 解 12 h；称 取250.0 mg 二甲基苯腈 蓝，加10 mL 水溶 解；称 取 50.0 g 蔗糖，加30 mL 水溶 解。混合 以上3 种溶液，加 水定 容至100 mL，在 4 下 保存。4.2.7 CMV 病 毒检测上 游引 物 CMV-F:5-TTCGATAAGAAGCTTGTTTCGCG-3，下游引 物 CMV-R:5-AGACGTGGGAATGCGTTGGTGCT-3。预期 扩增 目的 片段 大小 为345 bp(参见 附录A 中的A.1)。4.2.8 WMV 病 毒 检 测 上 游 引 物 WMV-F:5-CCAGTGGCAAAGGTGATA-3，下 游 引 物 WMV-R:5-TGCTGCGTCTGAGAAATG-3。预期 扩增 目的 片段 大小 为 435 bp(参见 附录A 中的 A.2)。4.2.9 ZYMV 病 毒 检 测 上 游 引 物 ZYMV-F:5-ATGCAGAGGCACCATACAT-3，下 游 引 物 ZYMV-R:5-TACTGCATTGTGTTCACACC-3。预 期扩 增目 的片 段大 小为 283 bp(参 见附 录 A 中的 A.2)。4.2.10 引物溶 液：用 TE 缓 冲液（见4.6）将 上述 引物 稀释 到 10 mol/L。5 仪器和 设备 分析天 平、组 织研 磨仪、PCR 扩增 仪、电 泳槽、电泳 仪等电 泳装置、Nanodrop 微量分 光光度 计、凝胶成像 系统 或照 相系 统、切胶仪、离 心机。6 对照设 置 阳性对 照 以通过RT-PCR 扩 增和 测序 分析明 确含 有CMV、WMV、ZYMV 的 样品 为阳 性对 照。阴性对 照 通过RT-PCR 扩增 明确 不含 有CMV、WMV、ZYMV 的 样品 为阴性 对照。DB15/T 3534 2024 3 空白对 照 以灭菌ddH2O 作 为模 板进 行PCR扩 增的 产物 为空 白对 照。7 样品采 集 采集有 明显 症状 的疑 似病 毒感染 的籽 用西 葫芦 叶片，放入 自封 袋中 封口 后，快 速冷冻 于液 氮或 干 冰中，进 行检 测分 析。如需 长期保 存可 置于-80 冰 箱中。样品 应避 免交 叉污 染。8 样品病 毒检 测 重复次 数 每个对 照和 试样 设置2次 重 复。RNA 提 取和 质量 检测 8.2.1 RNA 提 取：将 样品 在液 氮下 研磨至 粉状 后称 取 0.1 g，置于灭 菌 2 mL 离心 管中，加入1 mL TRIzol试剂后 混 匀，提 取 总 RNA。8.2.2 RNA 浓度 检测：提 取的 样品 总RNA 用Nanodrop 微量 分 光光度 计测 定RNA 相 对浓 度，当OD260/OD280比值 为1.8 2.0 时，可 用 于 RT-PCR 检测。8.2.3 RNA 完 整性 检测：取2 L RNA 与4 L 加 样缓 冲液 混合后，加 入凝 胶点 样孔，进行电 泳检 测。电泳结 束后，观 察结 果（参见附 录 B.1）。如 果总RNA 条 带清 楚，就可 以用 于 后续实 验。反转录 在离心 管中 加入1 g RNA 模板，1 L Anchored Oligo（dT）18 引物 和RNase-Free ddH2O，混 匀，65 孵育5 min，冰浴2 min。然后加 入10 L 2 TS 反应液，1 L 反 转录 酶 和1 L gDNA Remover，轻轻混 匀，42 孵 育30 min。85 加热5 sec 终止 反应，-20 冰 箱保 存备 用。PCR 扩增 8.4.1 在PCR 管中 按 表 1 依 次加 入反应 试剂，混 匀。表1 PCR 扩 增体 系 试剂 体积 Premix Taq 25 L cDNA 2 L 10 mol/L 上游引物 1 L 10 mol/L 下游引物 1 L ddH2O 补足50 L 8.4.2 将PCR 管放 入离 心机 中，瞬时离 心 2 sec，取 出 PCR 管，放入PCR 仪中。8.4.3 PCR 反 应程 序：94 预 变 性3 min；94 变性30 sec，退 火 30 sec（CMV 58，WMV 50，ZYMV 50），72 延 伸 1 min，35 个 循环；72 延 伸10 min，4 保 存。8.4.4 反应结 束后 取 出 PCR 管，对 PCR 扩 增产 物进 行电 泳 检测。琼脂糖 凝胶 电泳 检测 DB15/T 3534 2024 4 8.5.1 称量1 g 琼脂 糖加 入到 100 mL 1 TAE 缓 冲液 中，加热混 匀。冷却 后加 入 8 L 核 酸染 料，混匀，将 其倒 入电 泳槽，插 上梳板。室 温下 凝固 成凝 胶后，倒 入 1TAE 缓冲 液 中，垂 直向 上轻 轻拔 去 梳板。取 5 L PCR 产 物与10 L 加样 缓冲 液混 合后，加入凝 胶点 样孔，同 时在 其中一 个点 样孔 加 入 DNA分子量 标准，进 行电 泳检 测。8.5.2 电泳结 束后，取 出琼 脂糖 凝胶，置于 凝胶 成像 仪上 成像，进行 结果 分析。测序验 证 PCR 产物 用凝 胶回 收试 剂 盒纯化 目的 片段，并 在4 连接 至pMD18-T载 体，转 化到大 肠杆 菌感 受态细胞DH5a，经蓝 白斑 筛选，挑取 阳性 克隆，送至 公 司测序。获 得的 序列 与NCBI 数据 库的CMV、WMV、ZYMV病毒序 列(参见 附录A)比 对，确定PCR 扩增 的DNA 片段 是否为 目的DNA 片段。9 结果分 析 参见附 录B.2,阳 性对 照 CMV 在345 bp、WMV 在 485 bp、ZYMV 在283 bp 处 有 目标条 带，阴性 和空白对照 无条 带，判定 结果 有效。阳性 对照 无条 带或 阴性和 空白 对照 有条 带，判定结 果无 效，需要 重 复 检测。当 结果 有效 时，试样 检测出 目标 条带 判定 为病 毒感染。DB15/T 3534 2024 5 A A 附录A（资料 性）籽用西 葫芦 叶 片 CMV/WMV/ZYMV 特异 性片 段序 列 A.1 CMV 特 异性 片段 序列 A.2 WMV 特 异性 片段 序列 A.3 ZYMV 特异 性片 段序 列 注1：序列方向为5-3。注2：5 下划线为PCR 上游引物序列，3 下划线为PCR 下游引物的反向 互补序列。DB15/T 3534 2024 6 B B 附录B（资料 性）籽用西 葫芦 叶 片CMV/WMV/ZYMV 的 RT-PCR 检测 电泳 图 B.1 籽用西 葫芦 叶片 总 RNA 电 泳图谱 见 图B.1。图B.1 籽用 西葫 芦叶 片总RNA 电 泳图 B.2 籽用西 葫芦 叶片 病 毒 RT-PCR 检 测电 泳图 见图 B.2。CMV WMV DB15/T 3534 2024 7 标印序号说明：M DNA 分子量标准 1-2 感染病毒的检测 样品 3-4 未感染病毒的检 测样品 PC1-PC2 阳性对照 NC1-NC2 阴性对照 CK1-CK2 空白对照 图B.2 籽用 西葫 芦叶 片病 毒 RT-PCR 检 测电 泳图 ZYM V