动物疫病诊断技术 第2部分：α疱疹病毒DB37／T 4725.2—2024.pdf

ICS 65.020.30 CCS B 44 37 山东省地方标准 DB37/T 4725.2 2024 动物疫病 诊断技术 第2 部分：疱 疹病毒 Diagnostic techniques of animal disease Part 2:Alpha herpes virus 2024-06-28 发布 2024-07-28 实施 山东省市 场监督 管 理局 发 布 DB37/T 4725.2 2024 I 前 言 GB/T 1.1 2020 1 DB37/T 4725 2 DB37/T 4725 2 DB37/T 4725.2 2024 II 引 言 DB37/T 4725 DB37/T 4725 1 2 herpes viruses DNA 3 DB37/T 4725.2 2024 1 动 物疫病 诊断技术 第 2 部分：疱疹 病毒 1 范围 2 规范性 引用 文件 GB/T 6682 NY/T 541 3 术语和 定义 4 流行特 点 猪伪狂 犬病 4.1 Porcine pseudorabies virus PRV 鸡马立 克氏 病 4.2 2 Gallid Alphaherpesvirus 2 GaHV-2 Marek s disease virus MDV 2 5 牛传染 性鼻 气管 炎 4.3 1 Bovine herpesvirus 1 BoHV-1 马鼻肺 炎 4.4 1 4 8 Equine herpesvirus type EHV-1/4/8 DB37/T 4725.2 2024 2 5 诊断 临 床诊 断 5.1 5.1.1 猪伪狂 犬病 2 6 1 5.1.2 鸡马立 克氏 病 3 4 5.1.2.1 5.1.2.2 50 70 5.1.2.3 5.1.2.4 5.1.3 牛传染 性鼻 气管 炎 7 5.1.3.1 40 5.1.3.2 5.1.3.3 5.1.3.4 6 5.1.4 马鼻肺 炎 2 10 1 2 3 实验室 诊断 5.2 5.2.1 猪伪狂 犬病 5.2.1.1 样品采 集 NY/T 541 5.2.1.2 聚合酶 链式 反应（PCR）检 测与电 泳分 析 PRV 200 L DNA DNA PCR 1 gE gB A 368 bp 480 bp DB37/T 4725.2 2024 3 表1 普通 PCR 引 物信 息 5 3 PRV-gE-F TTTGGATCCATGCGGCCCTTTCTG 368 bp PRV-gE-R TTTGAATTCTTACGACACGGCGTCGCA PRV-gB-F AGGTGTCGTTGGTGGTGT 480 bp PRV-gB-R ACGGCGACCTGGACG 5.2.1.3 实时荧 光定 量PCR（qRT-PCR）检 测 PRV 5.2.1.2 DNA PCR 2 gE gB qRT-PCR B 表2 荧光定 量PCR 引 物信 息 5 3 qPRV-gE-F CTGTACGTGCTCGTGATGAC 96 bp qPRV-gE-R CTCCTTGRTGACCGTGACG qPRV-gB-F GTCCGTGAAGCGGTTCGTGAT 95 bp qPRV-gB-R ACAAGTTCAAGGCCCACATCTAC 5.2.1.4 野毒分 离与 检测 qRT-PCR 3 5 000 rpm 10 min 0.22 m PK-15 1 000 IU/mL 1 000 g/mL 37 1 h 3%FBS DMEM 3 5 CPE 5.2.1.5 数据处 理分 析 5.2.1.5.1 PCR 1.0%DNA 368 bp 480 bp pMD-18T NCBI C 95%5.2.1.5.2 qRT-PCR Ct 35 S Ct 35 S 5.2.1.5.3 PK-15 CPE DNA PCR qRT-PCR CPE 3 CPE 5.2.2 鸡马立 克氏 病 5.2.2.1 采集病 料样 品 NY/T 541 5.2.2.2 PCR 检 测与 电泳 分析 DB37/T 4725.2 2024 4 DNA 3 PCR A PCR 1.0%360 bp 5.2.2.3 qRT-PCR 检测 5.2.2.2 DNA qRT-PCR 3 qRT-PCR B 表3 引物信 息 5 3 MDV073-F ATTTGATTCAGATTTTGTTTCT 360 bp MDV073-R GCTGTTGTACATTCCGTTCGCGC qMDV073-F GTTTCTCCAGATTCCACCTC 213 bp qMDV073-R TGCAACAATGCGTTCTTAT 5.2.2.4 野毒分 离与 检测 qRT-PCR 2 3 5 000 rpm 10 min 0.22 m DEF 1 000 IU/mL 1 000 g/mL 37 1 h 3%FBS DMEM 3 5 CPE 5.2.2.5 数据处 理分 析 5.2.2.5.1 PCR 1.0%DNA 360 bp pMD-18T NCBI C 95%2 5.2.2.5.2 qRT-PCR Ct 35 S Ct 35 S 2 5.2.2.5.3 DEF CPE DNA PCR qRT-PCR CPE 3 CPE 5.2.3 牛传染 性鼻 气管 炎 5.2.3.1 病料样 品采 集 NY/T 541 5.2.3.2 PCR 检测 DNA 4 PCR A PCR 1.0%479 bp 5.2.3.3 qRT-PCR 检测 5.2.3.2 DNA qRT-PCR 4 qRT-PCR B DB37/T 4725.2 2024 5 表4 引物信 息 5 3 BoHV-1 gB-F TACGACTCGTTCGCGCTCTC 479 bp BoHV-1 gB-R GGTACGTCTCCAAGCTGCCC qBoHV-1 gB-F CTGGCACACGACGGACGATG 97 bp qBoHV-1 gB-F CGCCTCCACTTCTTCCACGATG 5.2.3.4 野毒分 离与 检测 qRT-PCR 1 3 5 000 rpm 10 min 0.22 m MDBK 1 000 IU/mL 1 000 g/mL 37 1 h 3%FBS DMEM 3 5 CPE 5.2.3.5 数据处 理分 析 5.2.3.5.1 PCR 1.0%DNA 479 bp pMD-18T NCBI C 95%1 5.2.3.5.2 qRT-PCR Ct 35 S Ct 35 S 1 5.2.3.5.3 MDBK CPE DNA PCR qRT-PCR CPE 3 CPE 5.2.4 马鼻肺 炎 5.2.4.1 病料样 品采 集 NY/T 541 5.2.4.2 PCR 检测 DNA 5 PCR A PCR 1.0%792 bp 482 bp 316 bp 表5 PCR 引 物信 息 5 3 EHV-1 gB-F GAACCTCAGCCAACCCA 792 bp EHV-1 gB-R GCACTTTGCGGACGAAC EHV-4 gB-F TTGCCGCAACTCGCTCGTCAAG 482 bp EHV-4 gB-F CTTAATCGCATTTAGACCGA EHV-8 gG-F TCAGACTGTCACTCGTGGGA 316 bp EHV-8 gG-R CCTGAAGGCCGTTTAACACA DB37/T 4725.2 2024 6 5.2.4.3 qRT-PCR 检测 5.2.4.2 DNA qRT-PCR 6 qRT-PCR B 表6 qRT-PCR 引 物信 息 5 3 qEHV-1 gB-F GCCATACGTCCCTGTCCGACAA 302 bp qEHV-1 gB-R CCTCCACCTCCTCGACGATGC qEHV-4 gB-F CGCAGAGGATGGAGACTTTTACA 78 bp qEHV-4 gB-F CATGACCGTGGGGGTTCAA qEHV-8 gG-F GACGCGTAACGTTGGATGTG 178 bp qEHV-8 gG-R AATGTAACGTTTGCCCACGC 5.2.4.4 野毒分 离与 检测 qRT-PCR EHV-1/4/8 3 5 000 rpm 10 min 0.22 m RK-13 1 000 IU/mL 1 000 g/mL 37 1 h 3%FBS MEM 3 5 CPE 5.2.4.5 数据处 理分 析 5.2.4.5.1 PCR 1.0%DNA 792 bp 482 bp 316 bp pMD-18T NCBI C 95%1 4 8 5.2.4.5.2 qRT-PCR Ct 35 S Ct 35 S 1 4 8 5.2.4.5.3 RK-13 CPE DNA PCR qRT-PCR CPE 3 CPE 综合判 定 5.3 PCR PCR DB37/T 4725.2 2024 7 A A 附录A（规范 性）聚合酶 链式 反应（PCR）检 测与分 析方 法 A.1 命名(polymerase chain reaction PCR)PCR A.2 原理 DNA 95 55 72 3 DNA 30 A.3 试剂或 材料 A.3.1 Taq premix A.3.2 A.3.3 GB/T 6682 A.3.4 DNA A.3.5 0.2 mL PCR A.3.6 Agarose A.3.7 DNA maker A.4 仪器设 备 A.4.1 PCR A.4.2 A.5 试验步 骤 PCR A.1 GB/T 6682 95 3 min 95 60 s 55 30 s 72 60 s 30 72 10 min 4 PCR 1.0%表A.1 PCR 体 系配 制 L 2 PCR Mix 10 10 1 10 1 2 6 20 DB37/T 4725.2 2024 8 B B 附录B（规范 性）实时荧 光定 量PCR（qRT-PCR）检 测 B.1 命名 PCR Quantitative real time polymerase chain reaction qRT-PCR B.2 实验原 理 qRT-PCR DNA PCR DNA B.3 实验试 剂与 耗材 SYBR Green qPCR Mix GB/T 6682 DNA PCR B.4 实验步 骤 PCR B.1 GB/T 6682 95 30 s 95 10 s 60 30 s 40 95 15 s 60 60 s 95 15 s PCR 表B.1 qRT-PCR 体 系配 制 L SYBR Green qPCR Mix 10 10 1 10 1 DNA 1 7 20 DB37/T 4725.2 2024 9 C C 附录C（资料 性）PCR 和qRT-PCR 目的 基因 序列 C.1 猪伪狂 犬病 毒 gE 基因 PCR 参考序 列(大小 为368 bp)TTTGGATCCATGCGGCCCTTTCTGCTGCGCGCCGCGCAGCTCCTGGCGCTGCTGGCCCTGGCGCTCTCCACCGAGGCCCCGAGCCTCTCCGCCGAGACGACCCCGGGCCCCGTCACCGAGGTCCCGAGTCCCTCGGCCGAGGTCTGGGACGACCTCTCCACCGAGGCCGACGACGATGACCTCAACGGCGACCTCGACGGCGACGACCGCCGCGCGGGCTTCGGCTCGGCCCTCGCATCCCTGAGGGAGGCGCCCCCGGCCCATCTGGTGAACGTGTCCGAGGGCGCCAACTTCACCCTCGACGCGCGCGGCGACGGCGCCGTGCTGGCCGGGATCTGGACGTTCCTGCCCGTCCGCGGCTGCGACGCCGTGTCG C.2 猪伪狂 犬病 毒 gE 基因 qRT-PCR 参考 序列(大小 为 96 bp)(用于 鉴别 野毒)CTGTACGTGCTCGTGATGACCCACAACGGCCACGTCGCCACCTGGGACTACACGCTCGTCGCCACCGCGGCCGAGTACGTCACGGTCAYCAAGGAG C.3 猪伪狂 犬病 毒 gB 基 因参 考 序列(大小 为480 bp)(用 于常规 检测)AGGTGTCGTTGGTGGTGTGCCAGCCGCGGGTGCCGAGCGCGTTCAGGCGCGAGGGGCGCAGGTCCACCTCGACGGGGTTCTCGTCGCGGTCGAAGGCGGTCACCTTGTGGTTGTTGCGCACGTACTCGGCCTTGGAGACGCACTTGCCGCGGCGGTCGATCACGTCCGTGATCTCCTGCACGGGGACGGGCACGCGGTCCGTGAAGCGGTTCGTGATGGCCGCGTACGTGCTCCCGGACCACACGGTCGTGACGATGACGTTCTTGTAGTAGATGTGGGCCTTGAACTTGTGCGGGGCGATGTTCTCCTTGAAGAGCAAGGCGATCCCCTCCGTGAAGTTGCGCCCCTGCGAGTACTCGGGGCAGGCCTGCTCGGGCTCCAGGAGCACCACCGTGGAGCCGGACGGCGGCGGGCAGACGTAGAAGCGGTCCCGCTCGGTCGCGGCCGCGCGCACGGCCGTGCGCGCGTCCAGGTCGCCGT C.4 猪伪狂 犬病 毒 gB 基因 qRT-PCR 引物 参考 序列(大小 为 95 bp)(用 于常 规检 测)GTCCGTGAAGCGGTTCGTGATGGCCGCGTACGTGCTCCCGGACCACACGGTCGTGACGATGACGTTCTTGTAGTAGATGTGGGCCTTGAACTTGT C.5 禽疱疹 病 毒2 型MDV073 基因 PCR 参考 序列(大 小为360 bp)ATTTGATTCAGATTTTGTTTCTCCAGATTCCACCTCCCCAGAATCCACTCCCCCAACGACAATGCCTGCACAGAAAGCCATTAACAAACATACAGTATCCCATAATGGTGTTTTTACGTCTGCCGTTCTACCGACTAACATACCAGCGAAAAATGACATGCACGATCCTAGTAATAATGATTTTGCAGAACAGATCAATGTAACCAGCATATAAGAACGCATTGTTGCATTCTCTGACTCCACGGATAGAATAGTACGGGGTCGTTGTACAAGAACCCGTTTTTTATTCAAATGCTCCCCCAATATATTTGGGTTTTGTCTTTCGGCCAGCATTAATGCGCGAACGGAATGTACAACAGC C.6 禽疱疹 病 毒2 型MDV073 基因 qRT-PCR 参考 序列(大小为 213 bp)GTTTCTCCAGATTCCACCTCCCCAGAATCCACTCCCCCAACGACAATGCCTGCACAGAAAGCCATTAACAAACATACAGTATCCCATAATGGTGTTTTTACGTCTGCCGTTCTACCGACTAACATACCAGCGAAAAATGACATGCACGATCCTAGTAATAATGATTTTGCAGAACAGATCAATGTAACCAGCATATAAGAACGCATTGTTGCA C.7 牛疱疹 病 毒1 型gB 基因PCR 参 考序 列(大 小为479 bp)TACGACTCGTTCGCGCTCTCGACCGGGGACATTATCTACATGTCGCCCTTTTACGGGCTGCGCGAGGGCGCGCACCGCGAGCACACCAGCTACTCGCCGGAGCGCTTCCAGCAGATCGAGGGCTACTACAAGCGCGACATGGCCACGGGCCGGCGCCTCAAGGAGCCGGTCTCGCGGAACTTTTTGCGTACACAGCACGTGACGGTAGCCTGGGACTGGGTGCCCAAGCGCAAAAACGTGTGCTCGCTGGCCAAGTGGCGCGADB37/T 4725.2 2024 10 GGCGGACGAAATGCTGCGAGACGAGAGCCGCGGGAACTTCCGCTTCACGGCCCGCTCGCTCTCGGCGACCTTTGTGAGCGACAGCCACACCTTCGCGTTGCAGAATGTGCCGCTGAGCGACTGCGTGATCGAAGAGGCCGAGGCCGCGGTCGAGCGCGTCTACCGCGAGCGCTACAACGGCACGCACGTGCTGTCGGGCAGCTTGGAGACGTACC C.8 牛疱疹 病 毒1 型gB 基因qRT-PCR 参 考序 列(大 小为 97 bp)CTGGCACACGACGGACGATGTGTACACGGCGCTGGGCTCGGCGGGGCTCTACCGCACGGGCACCTCTGTGAACTGCATCGTGGAAGAAGTGGAGGCG C.9 马疱疹 病 毒1 型gB 基因PCR 参 考序 列(大 小为792 bp)GAACCTCAGCCAACCCAAGATGGTGTGCATAGAGAACAAATTCTACATCGCTTGCACAAACGAGCAGTGGAGGCAACGGCAGGTACCGATTCTTCCAACGTCACCGCCAAACAGCTGGAGCTCATCAAAACCACGTCGTCTATCGAGTTTGCCATGCTACAGTTTGCATACGATCACATCCAATCCCACGTCAATGAAATGCTAAGTAGAATAGCAACTGCGTGGTGTACCCTCCAAAACAAAGAGCGGACCCTATGGAACGAAATGGTGAAGATTAACCCGAGCGCCATAGTCTCCGCAACCCTTGACGAGCGAGTTGCAGCGAGGGTCCTGGGGGACGTGATAGCTATAACGCACTGCGCCAAAATAGAGGGCAACGTGTACTTGCAAAACTCCATGCGCTCGATGGACAGTAACACGTGCTACTCCCGCCCCCCCGTAACATTTACAATTACTAAGAATGCAAACAACAGAGGGTCGATAGAAGGCCAGCTGGGAGAGGAGAACGAGATTTTCACGGAGCGCAAGCTGATCGAGCCGTGCGCCCTCAATCAGAAGCGCTACTTTAAGTTTGGCAAAGAGTACGTTTACTACGAGAACTACACGTTCGTCCGCAAAGTGCCCCCCACGGAAATCGAGGTTATCAGCACGTACGTTGAACTAAACTTGACCCTTTTGGAAGACCGCGAGTTTCTGCCCCTGGAGGTGTACACGCGGGCTGAGCTGGAGGACACCGGCCTGCTAGACTACAGCGAAATACAGCGCCGCAACCAGCTCCACGCTCTCAGGTTTT C.10 马疱疹 病 毒1 型gB 基因qRT-PCR 参 考序 列(大 小为302 bp)GCCATACGTCCCTGTCCGACAGATACAATGACAGGGTTCCGGTTTCGGTGGAGGAGATCTTCGGTCTCATCGACAGTAAGGGAAAATGTTCGTCAAAGGCCGAGTACCTCAGAGATAACATCATGCACCACGCGTACCACGACGACGAGGACGAGGTGGAGCTTGATTTGGTGCCGTCCAAGTTTGCAACTCCGGGGGCCAGAGCCTGGCAGACCACCAACGATACTACGTCTTACGTGGGGTGGATGCCATGGAGGCACTACACGTCAACGTCTGTCAACTGCATCGTCGAGGAGGTGGAGG C.11 马疱疹 病 毒4 型gB 基因PCR 参 考序 列(大 小为482 bp)TTGCCGCAACTCGCTCGTCAAGAGTGGCGGAAACAATAGCGCTTGGGTTAACCTTTACCATCTCATTCCAGAGGGTCCGCTCTTTGTTTTGTAGTGTACACCACGCAGTTGCTATCCTACTTAGCATCTCATTAACGTGGGATTGGATGTGATCGTATGCAAACTGTAGCATAGCAAACTCAATAGAGGACGTTGTTTTGATTAGCTCTAGTTGTTTGGCGGTGACGTTGGAAGAGTTTGTACTATTCGCAGCCTCCACTGCTCGTTTGTGTAGGCGATGTAGTATTTGTTCTCTGTGGAGGCTCTCTTGGGTTGGAGTAGGTTCTGGTATTGATAGTAGCGACCTGCGTGTTCGATTGGTATTATGGTTTGCGTTGGGGTTTAACAGATTTTTTAGGTCATAGGTGCGGTTAGATCTCACAAGCTCGTTTAGGTACAGCCTGGCAAGTTCGTTAGAAATCATCGGTCTAAATGCGATTAAG C.12 马疱疹 病 毒4 型 gB 基因qRT-PCR 参 考序 列(大 小为78 bp)CGCAGAGGATGGAGACTTTTACACCTGCCCGCCGCCTACTGGATCCACAGTTGTACGCATTGAACCCCCACGGTCATG C.13 马疱疹 病 毒8 型 gG 基因PCR 参 考序 列(大 小为316 bp)TCAGACTGTCACTCGTGGGAGTCATACACCTATCCAAATACGCTGAGGCAGGCCACCGGACCCCAGACCTTGTTGGTAGGTGCAGTTGGACTCAGAATCTTGGCTCAGGCATGGAAGTTTGTTGGTGATGAAACGTACGACACCATCCGCGCAGAAGCAAAAAATCTAGAGACCCACGTACACTCCAGTGCAGCGGATTCGTCTTCCGAAAACCAATTGTCGCAGGAAAACGTAAACATTCCCGAAGTTGCCCACCTGCGAAGCTGCCAAAACGAAGACAATGCACACACAGGGGGTGTGTTAAACGGCCTTCAGG C.14 马疱疹 病 毒8 型gG 基因qRT-PCR 参 考序 列(大 小为178 bp)DB37/T 4725.2 2024 11 GACGCGTAACGTTGGATGTGGAAAAAGACACAAACTATCCATGTGGCATGATTCATGGACTTACTGCTTACGGAGACATCAACGTAGATGAGACCATGGACAACGCCAGCCCTCACCCGCGTGCCGTGGGGTGCTTTCCCGAGCCCATCGACAACGAAGCGTGGGCAAACGTTACATT