平菇液体菌种制备技术规范DB1310／T 345-2024.pdf

ICS 65.020.01 CCS B05 1310 廊坊市地方标准 DB 1310/T 3452024 平菇液体 菌种制备 技术规范 2024-06-28 发布 2024-07-28 实施 廊坊市市 场监督 管 理局 发 布 DB 1310/T 345 2024 I 前 言 本文件 按照GB/T 1.1 2020 标 准化 工作 导则 第1 部分：标准 化文 件的 结构 和起草 规则 的 规 定起草。本文件 由廊 坊市 农业 农村 局提出。本文件 起草 单位：廊 坊市 森淼春 食用 菌有 限公 司、廊坊师 范学 院、献县 农业 农村局、廊 坊市 自然 资源与规 划局、廊 坊市 农业 农村局。本文件 主要起 草人：周志 国、陈 文杰、解春 艳、王 艳、侯 桂森、任思 竹、付 强、闫 训友、史振 霞、张瑞青、杜 伟娜、王 素霞、乔丽 秀、李春 叶。DB 1310/T 345 2024 1 平 菇液体 菌种制备 技术规 范 1 范围 本文件 规定 了平 菇液 体菌 种的基 本要 求、生产 技术 和生产 档案 等要 求。本文件 适用 于平 菇液 体菌 种的制 备。2 规范性 引用 文件 下列文 件中 的内 容通 过文 中的规 范性 引用 而构 成本 文件必 不可 少的 条款。其 中，注日 期的 引用 文件，仅该日 期对 应的 版本 适用 于本文 件；不注 日期 的引 用文件，其 最新 版本（包 括所有 的修 改单）适 用 于 本文件。GB 150 压 力容 器 GB 5749 生活 饮用 水卫 生 标准 GB 19172 平菇 菌种 GB 50073 洁净 厂房 设计 规范 GB/T 4789.28 食品 微生 物学检 验 培养 基和 试剂 的 质量要 求 GB/T 12728 食 用菌 术语 NY/T 528 食用 菌菌 种生 产技术 规程 3 术语和 定义 GB/T 12728 界定 的以 及下 列术语 和定 义适 用于 本文 件。液体菌 种 在生物 发酵 罐中 通过 深层 培养(液体 发酵)技术 生产 的液体 形态 的食 用菌 菌种。母种 经 各 种 方法 选 育得 到 的具有 结 实 性的 菌 丝体 纯 培养物 及 其 继代 培 养物，以玻璃 试 管 为培 养 容器 和单位，也称 一级 种、试管 种。液体菌 种菌 龄 菌种接 入培 养基 开始 计算 的液体 菌种 培养 时间。发酵罐 空消 对尚未 加水 投料 的空 发酵 罐进行 高压 灭菌。发酵罐 实消 指对投 料后 的发 酵罐 进行 高压蒸 汽灭 菌。DB 1310/T 345 2024 2 通气量 单位时 间通 入发 酵罐 中无 菌空气 体积 与发 酵罐 体积 的比值。菌种活 力 菌种的 生长、繁 殖能 力。4 基本要 求 人员要 求 工作人 员应 该保 持个 人卫 生，进 液体 菌种 发酵 车间 须穿戴 经灭 菌处 理的 工作 服、口 罩、鞋、帽。场所要 求 生产场 所符 合NY/T 528 的 环境卫 生要 求，场 地开 阔、路面硬 化、卫 生清 洁。生 产 用水应 符合GB 5749要求。厂房及 设施 要求 厂房设 计应 符合 NY/T 528 要求。洁净 车间 应设 有多 功能实 验室、菌 种保 藏室、无菌 接种 室、摇 瓶室、发 酵罐 室，设计 符合GB 50073 要 求。生产设 备要 求 具有磅 秤、量筒、量 杯、天平、高压 蒸汽 灭菌 锅、发酵罐、液 体菌 种接 种器、超净 工作 台、调温 设备、恒 温培 养箱、恒 温摇 床或磁 力搅 拌器、冰 箱、显微镜 等及 其它 常规 用具。压力 容器 应每 年经 政 府 有关部门 检验 合格，符 合GB 150 要 求。具有 备用 电源。5 生产技 术 工艺流 程 工艺流 程步 骤如 图1 所示。图1 工艺流 程步骤 DB 1310/T 345 2024 3 母种活 化 母种活 化配 方及 操作 流程 应符合NY/T 528 要求。活 化后母 种质 量应 符合GB 19172 要 求。摇瓶液 体菌 种生 产 5.3.1 容器 使用无 色或 近无 色专 用玻 璃三角 甁做 摇瓶,使 用硅 胶 塞或专 用封 口透 气膜 进行 封口。5.3.2 培养基 配方 生产用 水应 符合GB 5749 要 求，培 养基 质应 符合NY/T 528 要 求，玉米 粉过30 目 筛。其中，培 养基 配方根据 成分 不同，分 为配方1和 配方2：配方1：葡 萄糖20 g，蛋 白胨5 g，酵母 膏2 g，磷 酸二氢 钾1 g，硫酸 镁 0.5 g，维 生素B1 10 mg，水 1 L，pH 6.0 6.5；配方2：玉 米粉10 g，葡 萄糖 20 g，酵母 膏 5 g，牛 肉膏2 g，磷酸 二氢 钾 2 g，硫酸 镁1 g，维生 素B1 10 mg，水1 L，pH 6.0 6.5。5.3.3 培养基 配制 按液体 培养 基配 方配 制，玉米粉 先用 温水 搅拌 均匀，装入 摇瓶 中，混合 均匀，装液量 为摇 甁容 量 的2/53/5，并用 专用 封口 透气膜 或硅 胶塞 封口。5.3.4 灭菌 将分装 好的 摇瓶 放入 灭菌 锅内，采用 高压 灭菌，灭 菌温度 控制 在121 122，维 持25 min 30 min。5.3.5 接种 灭菌后 的摇 瓶冷 却到 室温，无菌 接种，接 种7 块8 块规格 为（34）mm（3 4）mm（12）mm的母种 块于 摇瓶 培养 基内，菌种 块菌 丝面 朝上。5.3.6 摇瓶菌 种培 养 接种结 束后 封口，放 入恒 温箱中23 25 静置 培 养24 h，然后 置于 摇床 上 震荡培 养，摇床 温度控制在25 1，转速180 r/min，摇床 培养5 d6 d。培 养全 过程 要求 无光 或弱光 培养。5.3.7 摇瓶菌 种质 量标 准 培养液 澄清 透明，无杂 菌；镜 检无 杂菌、菌丝 形态 正常；菌 丝球、菌丝 片段 密集，静 置1 h后 菌丝 体体积不 低于 整个 培养 液体 积的80%，均匀 悬浮 于液 体 培养基 中不 分层。发酵罐 液体 菌种 生产 5.4.1 煮罐、空消 发酵罐 初次 使用、出 现杂 菌、长 期放 置、更换 品种 等情况 出现 其一 时，应煮 罐和空 消，煮罐 操作 步骤：在 发酵 罐中 充满 水，通蒸汽 加热 到100，煮 沸1 h，之 后冷 却。注意 冷 却过程 中保 持罐 内外 及夹DB 1310/T 345 2024 4 层内外 空气 流通，以 防罐 体受压 损伤。空 消操 作 步 骤：排 净发 酵罐 中的 水，直接在 发酵 罐中 通蒸 汽，温度126，维持40 min 60 min。5.4.2 发酵罐 液体 菌种 培养 基配 方 生产用 水应 符合GB 5749 要 求，培 养基 质应 符合NY/T 528 要 求，玉米 粉过30 目 筛。其中，培 养基 配方根据 成分 不同，分 为配 方1和 配方2：配方1：玉 米粉8 g，葡 萄 糖15 g，酵 母 膏3 g，牛 肉 膏2 g，磷 酸二 氢钾2 g，硫酸 镁1 g，维生素B1 10 mg，泡敌0.4 g，水1 L，pH 6.0 6.5；配方2：玉 米粉10 g，麦 麸20 g（煮 汁），葡 萄 糖15 g，蛋白 胨3 g，磷酸 二 氢钾 2 g，硫酸镁1 g，泡 敌0.4 g，水 1 L，pH 6.0 6.5。5.4.3 投料和 定容 用温水 把 玉米 粉等 原料搅 拌均匀，混合 后加 入罐体，装液 量为罐 体容 量的60%70%，加入0.4泡敌做为 消泡 剂，通入 空气 鼓气搅 拌1 min 2 min，混 合均匀，拧 紧上 料口 盖。5.4.4 发酵罐 实消 发酵罐 通入 蒸汽 加热。待 罐压达 到0.05 MPa 时，缓 慢 打开排 气阀 降压 至0 MPa 排 净冷空 气，关闭 排气阀，通蒸 汽升 压至0.11 MPa，维 持80 min 90 min。在 位 灭菌的 空气 过滤 器要 通过 阀门通 蒸汽 灭菌30 min，其他与 外界 有流 通的 阀门 开口如 取样 口、排污 口、接种口 等均 要通 蒸汽30 min 灭菌。5.4.5 冷却 灭菌结束，关闭空气过滤 器灭菌阀与排气阀，缓慢 打开空气过滤器排水阀降 压至0 MPa，夹层 通 入冷水降 温；同 时缓 慢打 开 发酵罐 排气 阀降 压，待 压 力接近0.01 MPa 时 通过 空气 过滤器 向培 养层 内通 入无菌空气，调 整排 气阀，维 持罐压0.04 MPa 0.05 MPa，培养 液温 度降 至25 时，关闭 夹层 进水 阀。5.4.6 接种 接入摇 甁菌 种，接 种量 为0.5 1。将摇 瓶接 种管 和发酵 罐外 接种 口用75%酒 精消毒，用95%酒精的火焰 圈套 在接 种口 上，使发酵 罐压 力为0.01 MPa，并有气 体排 出。点 燃火 焰 圈，在火 焰保 护下 将摇 瓶菌种倒 入发 酵罐 接 种 口，盖上接 种口 盖子，去 掉火 焰圈，拧紧 接种 口盖。5.4.7 发酵罐 菌种 培养 根据菌 丝生 长情 况，适时 调节进 气按 钮，调节 通气 量，通 入适 量无 菌空 气，同时调 节排 气阀，维 持罐压0.03 MPa 0.05 MPa，培养温 度控 制在23 25，培 养6 d7 d。5.4.8 发酵罐 液体 菌种 质量 标准 平菇发 酵罐 液体 菌种 感官 见表1。DB 1310/T 345 2024 5 表1 平菇发 酵罐 液体 菌种 感官 要求 项目 要求 菌液色泽 菌丝球或菌丝片段呈白色，菌液呈浅棕色 菌液形态 培养液澄清透明，菌丝球、菌丝片段均匀悬浮于液体中，不分层，直径小于3.5 mm 菌液气味 有平菇液体培养时特有的香气，无酸、臭等异味，发酵罐排气口气味正常，无明显改变 显微镜下 菌丝形态 可见平菇菌种液体培养中特有的菌丝形态，菌丝粗壮，分支较少，无杂菌 pH 5.36.0 菌丝湿重（g/mL）0.20.25 菌种活力检测 菌丝日平均生长速度不低于0.5 cm 霉菌 无 细菌 无 5.4.9 发酵罐 液体 菌种 检测 发酵罐 液体 菌种 检测 方法 如下：形态学 观察：主 要是 通过 肉眼观 察菌 球形 态，包括 菌液色 泽、菌液 形态、通 过鼻嗅 检测 菌液气味，通过 显微 镜观 察菌 丝体形 态。pH 测 定：通过 pH 计或 pH 试纸测 定菌 液酸 碱度。pH 小于 5 为不 正常。菌丝湿 重测 定：检测 发酵 水平，方法 是称 取一 定体 积的培 养液，经 10000 r/min 离心 5 min，称重。菌种活 力检 测：将液 体菌 种接种 到 PDA 平 皿中，测 量菌丝 日平 均生 长速 度。霉菌检 验：按照 无菌 操作 从取样 阀取 少量 疑有 霉菌 污染的 培养 液，接种 于 GB/T 4789.28 中规定 的PDA 培养 基中，置 于 35 37 恒温 培养48 h，采用 显微 镜和 感官 观 察菌丝 生长 状况和有 无杂 菌污 染；若出 现白色 以外 的杂 色者，或 有异味 者为 霉菌 污染 物，必要时 进行 水封片镜检。细菌检 验：按照 无菌 操作 从取样 阀取 少量 疑有 细菌 污染的 培养 液，接种 于 GB/T 4789.28 中规定的 营养 肉汤 培养 液中，置 于 28 35 恒温 培养 24 h48 h，观 察培 养液是 否浑 浊。培养液 浑浊，为 有细 菌污 染；培 养液 澄清，为 无细 菌污染。6 生产档 案 母种、摇 瓶液 体菌 种和 发 酵罐液 体菌 种生 产的 每个 环节都 要有 详实 的记 录。生产记 录归 档保 存，至少两年。