田野考古出土人类遗骸DNA获取技术规范 WWT 0036-2012.pdf

A16 备案号：37260-2012 WW 中华人民共和国文物保护行业标准 WW/T 0036 2012 田野考古出土人类遗骸DNA 获取技术规范 Technical specification for DNA extraction from archaeological human remains（报批稿）2012-07-31发布 中华人民共和国国家文物局 发 布 2012-08-01实施 省文旅标技委 目 次 WW/T 00362012 前言 1 范 围 1 2 术语和定义 1 3 样本采集、运输和保存 1 3.1 样本采集 1 3.2 样本运输 2 3.3 样本保存 2 4 样本评估 2 5 DNA提取 3 5.1 基本要求 3 5.2 古 DNA实验室基本设置 3 5.3 样本处理 3 5.4 DNA提取原理 4 5.5 硅 粒法 4 5.6 硅离心柱法a 5 5.7 硅离心柱法b 6 5.8 DNA提取液质量鉴定 7 6 真实性验证 8 6.1 实验室内部真实性验证 8 6.2 克隆测序 8 6.3 其他实验室重复验证 8 附录A（规范性附录）样本采集记录格式 9 附录B（规范性附录）样本保存现状记录格式 10 附录C（资料性附录）样本检测记录格式 11 参考文献 12 I 省文旅标技委 WW/T 00362012 II 省文旅标技委 前 言 本标准依据 GB/T 1.12009 给出的规则起草。本标准由中华人民共和国国家文物局提出。本标准由全国文物保护标准化技术委员会（SAC/TC 289）归口。本标准负责起草单位：吉林大学。本标准主要起草人：周慧、朱泓、蔡大伟、张全超、崔银秋、许月。WW/T 00362012 III 省文旅标技委 WW/T 00362012 IV 省文旅标技委 1 范 围 田野考古出土人类遗骸DNA获取技术规范 WW/T 00362012 本标准规定了田野考古出土人类遗骸DNA获取的基本操作技术及要求。本标准适用于田野考古出土人类遗骸DNA的获取。2 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。2.1 脱氧核糖核酸 DNA deoxyribonucleic acid 由脱氧核糖核苷酸构成的高分子聚合物。互补的双链呈双螺旋形，它是绝大多数生物的遗传物 质。2.2 聚合酶链反应 PCR polymerase chain reaction 一种体外扩增DNA的方法，可在混合的DNA中特异地扩增靶序列。2.3 外源DNA exogenous DNA 样本之外的DNA，例如考古发掘者、样本采集者、样本研究者以及DNA提取相关实验人员的 DNA。3 样本采集、运输和保存 3.1 样本采集 3.1.1 采集工具 骨骼样本采集工具：毛刷、小型电锯、小型电钻等。牙齿样本采集工具：毛刷、拔牙钳、牙钻等。软组织样本采集工具：手术刀、医用剪刀、镊子等。3.1.2 基本要求 在考古发掘过程中，对需要进行采集的样本，应减少人员直接接触，并避免阳光直射或雨淋，尤 其是不能用水清洗。对于特别潮湿的样本，应先置于阴凉处晾干。采集者应戴一次性无菌的头套、口罩、手套，使用无菌采集工具。为了避免样本间的交叉污染，每采集完一个样本后，均需更换新的无菌采集工具。对于不便更换 的采集工具应用5%次氯酸溶液清洗干净后再使用。对于接触样本的人员，宜用口腔拭子采集口腔黏膜细胞，或拔取数根带有毛囊的头发，以备后续 的真实性验证。3.1.3 采集方法 3.1.3.1 骨 骼 宜选择表面完整无破损且光滑致密的样本，放入一次性塑封袋中，并贴上样本标签（见图1）。对于特别珍贵的样本，可在骨骼局部位置用小型电锯切下一小块骨片（约2g），或用小型电钻钻 取适量骨粉（约2g）。切割骨片或者钻取骨粉前，应先用毛刷清理骨骼表面的泥土或其他沉积物，并 1 省文旅标技委 WW/T 00362012 用5%次氯酸溶液擦拭骨骼表面，以除去骨骼表面的外源DNA污染。样本标签 出土遗址：出土编号：采集时间：采集者：备注：年 月 日 3.1.3.2 牙 齿 图1 样本标签 用拔牙钳将牙齿从上颌骨或下颌骨中拔出，放入一次性塑封袋中，并贴上样本标签。对于特别珍贵的样本，可用牙钻在牙根部分钻取适量牙粉。钻取牙粉前，应先将牙齿置于5%次氯 酸中浸泡15min，以除去牙齿表面的外源DNA污染。3.1.3.3 软组织 采集毛发样本时，如果有毛囊应连同毛囊一起拔取数根，放入一次性塑封袋中，并贴上样本标 签。采集肌肉、皮肤以及脑和内脏等器官样本时，应用手术刀切取或医用剪子剪取部分样本，用镊子 夹取放入一次性塑封袋中，并贴上样本标签。3.1.4 采集记录 填写样本采集表，见附录A中的表A.1。3.2 样本运输 样本装箱时宜用泡沫塑料分隔固定，以避免在运输过程中样本颠簸受损。样本运输时，宜采用冷冻或冷藏运输方式。3.3 样本保存 样本入库时，样本库管理者应立即对样本进行照相，并保存电子文档和纸质文档。样本库管理者填写样本保存现状表，参见附录B中的表B.1。骨骼和牙齿等硬组织样本宜置于-20、软组织样本宜置于-80冰箱中保存。4 样本评估 实验前，研究人员要从多方面评估样本，以确定样本是否适合用于DNA提取,包括以下方面：a）样本的埋藏情况，包括有无墓室/棺椁、土壤特性、酸碱度、湿度等；b）样本的保存现状，包括入库时间，保存温度、湿度等；2 省文旅标技委 c）样本的外观形态特征，包括样本的质地、颜色、表面风化及破损情况等；WW/T 00362012 d）样本的保存状态测试评估，宜对样本进行DNA定量、天冬氨酸（Asp）外消旋反应速率、骨质 结构及成分分析等检测分析，参见附录C中的表C.1。5 DNA提取 5.1 基本要求 DNA提取的基本要求如下：a）所有实验操作均应在专门的古DNA实验室中完成；b）实验操作者应穿着无菌的实验服，戴一次性无菌头套、口罩和手套；c）在实验中应使用不含外源DNA的实验试剂；d）在实验中应使用一次性实验耗材，并经过高压蒸汽灭菌（0.1MPa，121，20min）；e）在实验中需多次重复使用的器具，应先进行超声清洗，接着用5%次氯酸溶液浸泡15min，最后 高压蒸汽灭菌；f）在进行实验前，应用5%次氯酸溶液擦拭超净操作台，并紫外线照射30min；g）在进行样本处理时，每处理完一个样本，应及时更换新的无菌牙钻钻头或电锯锯片；h）在进行实验过程中应设置空白对照，用来监测实验过程中的外源DNA污染。5.2 古 DNA实验室基本设置 5.2.1 古 DNA实验室功能分区及仪器设备如下：样本处理区：牙钻、小型电锯、冷冻研磨机、超净工作台等；DNA提取区：恒温摇床、高速冷冻离心机、超净工作台、微量移液器等；PCR加样区：小型高速离心机、冰箱、超净工作台、微量移液器等；PCR扩增区：PCR仪；DNA检测区：凝胶成像仪、电泳仪、紫外分光光度计、天平、冰箱、微波炉、微量移液器 等。5.2.2 样本处理区、DNA提取区和PCR加样区应配备独立的空气过滤系统。5.2.3 DNA检测区应设在与其他工作区不同的楼层或不同的建筑物里面，以避免PCR扩增产物对其他 工作区的污染。5.2.4 实验室应配备带紫外灯和正压气流的超净工作台。5.3 样本处理 5.3.1 骨骼的处理 首先用毛刷清理骨骼表面的泥土或其他沉积物，并用5%次氯酸溶液擦拭骨骼表面，以除去骨骼 表面的外源DNA。接着用电锯切下一小片骨片（约2g），用牙钻钻头打磨骨片表面（重复3遍，约打 磨掉1mm2mm厚），进一步除去骨表面的污垢和杂质。将打磨好的骨片置于5%次氯酸溶液中浸泡 15min。然后依次用超纯水、无水乙醇洗涤，此过程重复3遍，紫外线照射30min，晾干。最后将骨片放 入冷冻研磨机中，液氮冷却，打磨成骨粉，分装成500mg/管，-20冷冻保存。在样本采集过程中，切割获取的骨片可参考上述处理方法。在样本采集过程中，钻取的骨粉应先用5%次氯酸溶液中浸泡5min。然后依次用超纯水、无水乙醇 洗涤，此过程重复3遍，直接用于DNA提取。5.3.2 牙齿的处理 首先用毛刷清理牙齿表面的泥土或其他沉积物，将清理后的牙齿置于5%次氯酸溶液中浸泡 3 省文旅标技委 WW/T 00362012 15min。然后依次用超纯水、无水乙醇洗涤，此过程重复3遍，紫外线照射30min，晾干。最后将牙齿放 入冷冻研磨机中，液氮冷却，打磨成牙粉，分装成500mg/管，-20冷冻保存。在样本采集过程中钻取的牙粉，应先用5%次氯酸溶液中浸泡5min。然后依次用超纯水、无水乙醇 洗涤，此过程重复3遍，直接用于DNA提取。5.3.3 软组织的处理 采集的毛发样本，依次用超纯水、无水乙醇洗涤，此过程重复3遍，直接用于DNA提取。采集的皮肤、肌肉、脑和内脏样本，应先用无水乙醇擦拭表面，再用剪刀将其剪碎后，置于5%次 氯酸溶液中浸泡15min。然后依次用超纯水、无水乙醇洗涤，此过程重复3遍，直接用于DNA提取。5.4 DNA提取原理 本标准推荐三种基于硅法的DNA提取方法：硅粒法、硅离心柱法a、硅离心柱法b，其原理是：在 高盐溶液中，DNA可与二氧化硅结合，并能够被低盐溶液或水洗脱，通过简单的结合清洗洗脱步 骤即可获得纯DNA。硅粒法：利用二氧化硅微粒与DNA结合。硅离心柱法：利用离心柱中的硅胶膜与DNA结合。5.5 硅粒法 5.5.1 试 剂 除非另有规定,硅粒法所需试剂。5.5.1.1 二氧化硅微粒Silicon dioxide（SiO2）。5.5.1.2 异硫氰酸胍Guandine thiocyanate（GuSCN）。5.5.1.3 乙二胺四乙酸Ethylene diamine tetraacetic acid（EDTA）。5.5.1.4 蛋白酶K Proteinase K。5.5.1.5 三羟甲基氨基甲烷Tris hydroxymethyl aminomethane（Tris）。5.5.1.6 氯化钠Sodium chloride（NaCl）。5.5.1.7 盐 酸 Hydrochloric acid（HCl，37%）。5.5.1.8 无水乙醇 Ethanol（100%，EtOH）。5.5.2 缓冲液 利用5.5.1中的试剂配制下列缓冲液。5.5.2.1 裂解缓冲液（0.45mol/L EDTA，0.25mg/mL蛋白酶K，pH 8.0）。5.5.2.2 DNA结合缓冲液（5mol/L GuSCN，25mmol/L NaCl，50mmol/L Tris），室温避光保存。5.5.2.3 DNA清洗缓冲液（50%EtOH，125mmol/L NaCl,10mmol/L Tris，1mmol/L EDTA，pH 8.0）。5.5.2.4 DNA洗脱缓冲液（10mmol/L Tris，1mmol/L EDTA，pH 8.0）。5.5.3 二氧化硅微粒悬浮液1）二氧化硅微粒悬浮液的配制步骤如下：a）称量4.8g二氧化硅微粒，置于50mL离心管中，加入超纯水至40mL刻度线，涡旋振荡后，室温 静置1h；b）吸取39mL上清液到一个新的50mL离心管，涡旋振荡后，室温静置4h；c）移除35mL上清液，加入39 L HCl,涡旋振荡混匀，室温避光保存。5.5.4 DNA提取步骤 1）BIO 101公司的Ancinet DNA GLASSMILK 或QIAGEN公司的QIAEX Suspension是适合的市售产品的实例。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对这些产品 的认可。4 省文旅标技委 5.5.4.1 DNA释放 在裂解缓冲液的作用下，DNA从样本组织细胞中释放出来，具体步骤如下：WW/T 00362012 a）在装有500mg样本的15mL离心管中加入10mL裂解缓冲液，同时设置空白对照；b）用封口膜封好盖子，放入摇床，37、150r/min振荡16h-24h。5.5.4.2 DNA与二氧化硅微粒结合 DNA释放后，需将DNA与二氧化硅微粒结合，具体步骤如下：a）将上述样本及空白对照6000g离心2min，转移上清液至新的50mL离心管中；b）加入40mL DNA结合缓冲液和100 L 二氧化硅悬浮液，用浓盐酸调节pH值至4.0；c）用封口膜封好盖子，放入摇床，37、150r/min振荡3h；d）6000g离心2min，移除上清液，加入1mL DNA结合缓冲液，重新悬浮沉淀，将其转移至新的 1.5mL离心管中。5.5.4.3 DNA清洗 DNA与二氧化硅微粒结合后，应对二氧化硅微粒进行清洗，除去杂质，具体步骤如下：a）12000g离心1min，移除上清液，加入1mL DNA清洗缓冲液，重新悬浮沉淀；b）重复步骤 a）两次；c）12000g离心1min，移除上清液，室温开盖干燥二氧化硅微粒，大约15min。5.5.4.4 DNA洗脱 清洗完毕后，需将DNA从二氧化硅微粒上洗脱下来，具体步骤如下：a）加入80 L DNA洗脱缓冲液到干燥的二氧化硅微粒上，使其重新悬浮，56孵育10min；b）12000g离心4min，吸取上清液（不能吸到二氧化硅微粒）到新的1.5mL离心管中，-20或-80保存。注：可以重复步骤a）-b）进行第二次洗脱，增加溶液中的DNA总量，但DNA浓度会降低。5.6 硅离心柱法a 5.6.1 试剂和材料 除非另有规定,硅离心柱法a所需试剂和材料。5.6.1.1 硅离心柱2）。5.6.1.2 超滤浓缩管。5.6.1.3 DNA结合缓冲液2）。5.6.1.4 DNA清洗缓冲液2）。5.6.1.5 蛋白酶K Proteinase K。5.6.1.6 十二烷基硫酸钠Sodium dodecyl sulfate（SDS）。5.6.1.7 三羟甲基氨基甲烷Tris hydroxymethyl aminomethane（Tris）。5.6.1.8 盐 酸 Hydrochloric acid（HCl，37%）。5.6.2 缓冲液 利用5.6.1中的试剂配制下列缓冲液。5.6.2.1 裂解缓冲液（0.45mol/L EDTA，0.5%SDS，0.25mg/mL蛋白酶K，pH 8.0）。5.6.2.2 DNA洗脱缓冲液（10mmol/L Tris-HCl，pH 8.5）。5.6.3 DNA提取步骤 2）QIAGEN公司的QIAquick spin column（硅离心柱）、Buffer PB（DNA结合缓冲液）、Buffer PE（DNA清洗缓冲液）是适合的市售产品的实例。给出这一信息是为了方便本标 准的使用者，并不表示对这些产品的认可。5 省文旅标技委 WW/T 00362012 5.6.3.1 DNA释放 在裂解缓冲液的作用下，DNA从样本组织细胞中释放出来，具体步骤如下：a）在装有500mg样本的15mL离心管中加入3mL裂解缓冲液，同时设置空白对照；b）用封口膜封好盖子，放入摇床，50、220r/min振荡16h24h。5.6.3.2 DNA与硅胶膜结合 DNA释放后，需将DNA结合到硅胶膜上，具体步骤如下：a）将上述样本及空白对照6000g离心20min。转移上清液至超滤浓缩管中，离心使溶液浓缩到 100 L（离心时间随样品不同而不同）；b）加入500 L DNA结合缓冲液，用枪头反复抽吸混匀，将混合液转移到硅离心柱中；c）12000g离心1min，丢弃滤液。5.6.3.3 DNA清洗 DNA与硅胶膜结合后，应对硅胶膜进行清洗，除去杂质，具体步骤如下：a）加入500 L DNA清洗缓冲液到硅离心柱中，用枪头反复抽吸混匀；b）12000g离心1min，丢弃滤液；c）重复步骤a）-b）一次；d）12000g离心3min，丢弃滤液。5.6.3.4 DNA洗脱 清洗完毕后，需要将DNA从硅胶膜上洗脱下来，具体步骤如下：a）将硅离心柱放在一个新的1.5mL的离心管上；b）加入80 L DNA洗脱缓冲液到硅胶膜的中心，50孵育15min；c）12000g离心1min，收集滤液，-20或-80保存。5.7 硅离心柱法b 5.7.1 试剂和材料 除非另有规定,硅离心柱法b所需试剂和材料。5.7.1.1 硅离心柱3）。5.7.1.2 组织裂解液3）。5.7.1.3 DNA结合缓冲液3）。5.7.1.4 DNA清洗缓冲液a3）。5.7.1.5 DNA清洗缓冲液b3）。5.7.1.6 蛋白酶K Proteinase K。5.7.1.7 三羟甲基氨基甲烷Tris hydroxymethyl aminomethane（Tris）。5.7.1.8 盐 酸 Hydrochloric acid（HCl，37%）。5.7.1.9 DNA洗脱缓冲液（10mmol/L Tris-HCl，0.5mmol/L EDTA,pH 9.0）。5.7.2 DNA提取步骤 5.7.2.1 DNA释放 在裂解缓冲液的作用下，DNA从样本组织细胞中释放出来，具体步骤如下：a）在装有500mg样本的5mL离心管中加入1mL组织裂解液（含0.25mg/mL蛋白酶K），同时设置空 白对照；3）QIAGEN公司的QIAamp spin column（硅离心柱）、Buffer ATL（组织裂解液）、Buffer AL（DNA结合缓冲液）、Buffer AW1（DNA清洗缓冲液a）、Buffer AW2（DNA清洗缓 冲液b）是适合的市售产品的实例。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对这些产品的认可。6 省文旅标技委 b）用封口膜密封盖子，放入摇床，50、130r/min振荡16h-24h。5.7.2.2 DNA与硅胶膜结合 DNA释放后，需将DNA与硅胶膜结合，具体步骤如下：WW/T 00362012 a）将上述样本及空白对照6000g离心8min，转移700 L上清液到新的5mL离心管中；b）加入700 L DNA结合缓冲液，涡旋15s，70孵育10min；c）加入700 L无水乙醇，涡旋15s；d）将700 L混合液加入到硅离心柱中，6000g离心1min，丢弃滤液；e）重复步骤d）两次；f）将硅离心柱放到新的1.5mL离心管上。5.7.2.3 DNA清洗 DNA与硅胶膜结合后，应对硅胶膜进行清洗，除去杂质，具体步骤如下：a）加入500 L DNA清洗缓冲液a 到硅离心柱中，6000g离心1min，丢弃滤液；b）加入500 L DNA清洗缓冲液b 到硅离心柱中，6000g离心1min，丢弃滤液；c）12000g离心3min，丢弃滤液。5.7.2.4 DNA洗脱 清洗完毕后，需要将DNA从硅胶膜上洗脱下来，具体步骤如下：a）将硅离心柱转移到新的1.5mL离心管上；b）加入80 L DNA洗脱缓冲液到硅胶膜的中心；37孵育15min；c）6000g离心1min，收集滤液，-20或-80保存。5.8 DNA提取液质量鉴定 5.8.1 原 理 通过对DNA提取液进行PCR扩增，利用2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增的产物，来判断是否成功 提取古DNA。5.8.2 试 剂 除非另有规定,所需试剂。5.8.2.1 PCR反应试剂：10PCR缓冲液、MgCl2溶液（25mmol/L）、dNTPs混合液（10mmol/L）、Taq 酶（5U/L）。5.8.2.2 正向引物、反向引物：浓度25 mol/L，可根据需要自行设计引物，扩增长度宜在300bp以内。5.8.2.3 牛血清白蛋白：Bovine Serum Albumin（BSA,20mg/mL）。5.8.2.4 凝胶电泳试剂：琼脂糖、6u20957X胶载样缓冲液（0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯氰FF，30%甘油 水溶液）、溴化乙锭EB（10mg/mL），1TAE电泳缓冲液（40mmol/L Tris-HAc，1mmol/L EDTA）。5.8.3 PCR加样 在PCR加样室内，利用微量移液器依次将超纯水、PCR缓冲液、MgCl2溶液、BSA溶液、dNTPs混合 液、正向引物、反向引物、Taq酶和DNA提取液加入到离心管中混合，各成分的加入量参考表1，同时 设置空白对照。5.8.4 PCR扩增 在PCR扩增室，将加样后的离心管放置于PCR仪中，进行PCR扩增。PCR扩增条件：95 5min；36个循环（94 30s，4560 40s，72 45s）；最后72 10min。由于样本的保存状况千差万别，应根据样本的实际情况调整PCR反应条件和扩增条件。7 省文旅标技委 WW/T 00362012 表1 标准 PCR反应体系（25 L）成分 超纯水 PCR缓冲液 Mg2+BSA dNTPs 正向引物 反向引物 Taq酶 DNA提取液 5.8.5 PCR扩增产物检测 加入量（L）14 2.5 2.5 1.5 0.5 0.4 0.4 0.2 3 终浓度-1X 2.5 mmol/L 1.2mg/mL 200mol/L 0.4 mol/L 0.4 mol/L 1U/25L-PCR扩增完毕后，取5 L PCR扩增产物，至DNA检测室，利用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增的结 果，操作步骤如下：a）用天平称取1.2g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入60mL 1TAE电泳缓冲液，微波炉高火加热，待 琼脂糖完全溶解，室温冷却至50-60（未形成凝胶状），加入3 L溴化乙锭，充分混匀；b）将凝胶倒入凝胶托盘，插入合适的梳子形成加样孔，室温下放置10min-20 min；c）待凝胶完全凝结，小心拔出梳子，取出凝胶，放到电泳槽内；d）加入1TAE电泳缓冲液，刚好没过凝胶1mm；e）混合PCR扩增产物和1 L 6u20957X胶载样缓冲液，用微量移液器加至凝胶的加样孔内；f）关上电泳槽盖，接好电极插头，设置电场强度5 V/cm,时间20min-30min；g）取出凝胶，使用凝胶成像仪进行观察、分析、记录。6 真实性验证 6.1 实验室内部真实性验证 每个样本至少需进行两次独立的DNA提取，对每次提取的DNA分别进行PCR扩增，并对PCR扩增 产物进行正反向测序。对接触样本的人员进行DNA测序，与所获得的古DNA序列进行比对分析。6.2 克隆测序 为了避免古DNA碱基损伤所造成的PCR错配对真实性的影响，应随机选取20%的样本进行克隆测 序，每个样本挑取10个克隆测序，观察位点损伤情况。6.3 其他实验室重复验证 随机选取20%的样本送至其他实验室进行验证。8 省文旅标技委 附 录 A（规范性附录）样本采集记录格式 表 A.1提供了田野考古出土人类遗骸DNA提取样本采集记录表的格式。表 A.1 样本采集表 WW/T 00362012 遗址名称：遗址经纬度：遗址时代：遗址土壤酸碱度：遗址土壤湿度：遗址年平均气温：序号 出土编号 有无墓室/棺椁 出土时间 样本年代 样本部位 样本数量 样本性别 样本年龄 样本提供者：年 月 日。样本采集者：年 月 日。样本库管理者：年 月 日。接触样本 人员姓名 9 省文旅标技委 WW/T 00362012 附 录 B（规范性附录）样本保存现状记录格式 表 B.1提供了田野考古出土人类遗骸DNA提取样本保存现状记录表的格式。表 B.1 样本保存现状表 序号 出土 样本 样本表面风 样本 样本 磨损情况 入库时 入库后保存条件 入库后接触样 编号 部位 化破损程度 颜色 质地（牙）间（温度、湿度）本的人员姓名 样本库管理者：年 月 日。10 省文旅标技委 附 录 C（资料性附录）样本检测记录格式 表 C.1提供了田野考古出土人类遗骸DNA提取样本检测记录表的格式。表 C.1 样本检测表 WW/T 00362012 序号 出土编号 DNA测定 骨组织中天冬氨酸（Asp）外消 骨质结构电镜 骨胶原蛋白 羟基磷灰石 旋反应速率 结果 含量测定 含量测定 研究人员：年 月 日。11 省文旅标技委 WW/T 00362012 参 考 文 献 1 Rohland N,Hofreiter M.（2007）Ancient DNA extraction from bones and teeth,Nature Protocols，2（7）:1756-1762.2 Yang DY，Eng B,Waye JS,Dudar JC,Saunders SR.（1998）Technical Note:Improved DNA Extraction from Ancient Bones Using Silica-Based Spin Columns，American Journal of Physical Anthropology,105:539-543.3 Bouwman AS,Brown TA.（2002）Comparison between silica-based methods for the extraction of DNA from human bones from 18th to Mid-19th century London,Ancient Biomolecules,4（4）:173-178.4 Rohland N,Hofreiter M.（2007）Comparison and optimization of ancient DNA extraction,Biotechniques,42（3）:343-52.12 省文旅标技委