SSR分子标记鉴定甜瓜杂交种纯度技术规程DB6521／T 074-2024.pdf

I C S 6 5.0 2 0.0 1C C S B 2 165 21吐 鲁 番 市 地 方 标 准D B 6 5 2 1/T 0 7 4 2 0 2 4S S R 分 子 标 记 鉴 定 甜 瓜 杂 交 种 纯 度技 术 规 程T e c h n i c a l s p e c i f i c a t i o n f o r p u r i t y i d e n t i f i c a t i o n o f m e l o n v a r i e t i e sb y S S R m a r k e r m e t h o d2 0 2 4-0 5-1 7 发 布 2 0 2 4-0 6-1 7 实 施吐 鲁 番 市 市 场 监 督 管 理 局 发 布D B 6 5 2 1/T 0 7 4 2 0 2 4I前 言本 文 件 按 照 G B/T 1.1 2 0 2 0 标 准 化 工 作 导 则 第 1 部 分：标 准 化 文 件 的 结 构 和 起 草 规 则 的 规 定起 草。请 注 意 本 文 件 的 某 些 内 容 有 可 能 涉 及 专 利。本 文 件 的 发 布 机 构 不 承 担 识 别 专 利 的 责 任。本 文 件 由 新 疆 维 吾 尔 自 治 区 葡 萄 瓜 果 研 究 所 提 出。本 文 件 由 吐 鲁 番 市 农 业 农 村 局 归 口。本 文 件 起 草 单 位：新 疆 维 吾 尔 自 治 区 葡 萄 瓜 果 研 究 所、新 疆 葡 萄 瓜 果 技 术 开 发 服 务 公 司、新 疆 维 吾尔 自 治 区 种 业 发 展 中 心、新 疆 农 业 广 播 电 视 学 校。本 文 件 主 要 起 草 人：李 超、杨 英、陈 伟、杨 咪、孙 玉 萍、杨 军、耿 新 丽、徐 畅、赵 文 霞、李 婧、程晓 宇、张 银 欢。本 文 件 实 施 应 用 中 的 疑 问，请 咨 询 新 疆 维 吾 尔 自 治 区 葡 萄 瓜 果 研 究 所。对 本 文 件 的 修 改 意 见、建 议，请 反 馈 至 新 疆 维 吾 尔 自 治 区 葡 萄 瓜 果 研 究 所（鄯 善 县 苗 园 路 4 号）、吐 鲁 番 市 市 场 监 督 管 理 局（吐 鲁 番 市 高 昌 区 西 环 北 路 2 7 1 2 号）。新 疆 维 吾 尔 自 治 区 葡 萄 瓜 果 研 究 所（鄯 善 县 苗 园 路 4 号），联 系 电 话：0 9 9 5-8 3 8 9 2 3 3，邮 编：8 3 8 2 0 0。吐 鲁 番 市 市 场 监 督 管 理 局（吐 鲁 番 市 高 昌 区 西 环 北 路 2 7 1 2 号），联 系 电 话（传 真）：0 9 9 5-8 5 6 6 2 4 6，邮 编：8 3 8 0 0 0。D B 6 5 2 1/T 0 7 4 2 0 2 41S S R 分 子 标 记 鉴 定 甜 瓜 杂 交 种 纯 度 技 术 规 程1 范 围本 文 件 规 定 了 甜 瓜 品 种 纯 度 S S R（s i m p l e s e q u e n c e r e p e a t，S S R）分 子 标 记 鉴 定 的 原 理、仪 器 设 备 和P C R 反 应 相 关 试 剂、方 法 步 骤 和 纯 度 计 算 的 要 求。本 文 件 适 用 于 甜 瓜 杂 交 种 纯 度 鉴 定。2 规 范 性 引 用 文 件下 列 文 件 中 的 内 容 通 过 文 中 的 规 范 性 引 用 而 构 成 本 文 件 必 不 可 少 的 条 款。其 中，注 日 期 的 引 用 文 件，仅 该 日 期 对 应 的 版 本 适 用 于 本 文 件；不 注 日 期 的 引 用 文 件，其 最 新 版 本（包 括 所 有 的 修 改 单）适 用 于 本文 件。G B/T 3 5 4 3.1 农 作 物 种 子 检 验 规 程 总 则G B/T 3 5 4 3.2 农 作 物 种 子 检 验 规 程 扦 样G B/T 3 5 4 3.5 农 作 物 种 子 检 验 规 程 真 实 性 和 品 种 纯 度 鉴 定G B/T 6 6 8 2 分 析 实 验 室 用 水 规 格 和 试 验 方 法3 术 语 和 定 义下 列 术 语 和 定 义 适 用 于 本 文 件。3.1 品 种 纯 度 p u r i t y o f v a r i e t y指 品 种 在 特 征 方 面 典 型 一 致 的 程 度，用 本 品 种 的 种 子 数 占 供 检 作 物 种 子 数 的 百 分 率 表 示。3.2 简 单 重 复 序 列 s i m p l e s e q u e n c e r e p e a t(S S R)由 几 个 核 苷 酸（1 6 个）为 重 复 单 位 聚 集 而 成 的 长 达 几 十 个 至 几 百 个 b p（一 般 为 1 0 0 2 0 0）的 串联 重 复 序 列，又 称 微 卫 星 序 列 或 短 串 联 重 复 序 列，其 高 度 多 态 性 主 要 来 源 于 串 联 数 目 的 不 同。3.3 聚 合 酶 链 式 反 应 p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n(P C R)利 用 D N A 在 体 外 9 5 高 温 变 性 成 单 链，低 温（通 常 是 5 5 6 0）时 引 物 与 单 链 按 碱 基 互 补 配 对的 原 则 结 合，温 度 再 调 至 D N A 聚 合 酶 最 适 反 应 温 度（7 2），D N A 聚 合 酶 沿 着 磷 酸 到 五 碳 糖（5 3）的 方 向 合 成 互 补 链。3.4 引 物 p r i m e rD B 6 5 2 1/T 0 7 4 2 0 2 42人 工 合 成 的 两 段 寡 核 酸 序 列。一 个 引 物 与 目 的 基 因 一 端 的 一 条 D N A 模 板 链 互 补，另 一 个 引 物 与 目的 基 因 另 一 端 的 另 一 条 D N A 模 板 链 互 补。4 原 理品 种 的 不 同 本 质 上 是 由 于 其 遗 传 物 质 D N A 核 苷 酸 序 列 不 同 所 致。S S R 广 泛 分 布 于 甜 瓜 整 个 基 因 组 中，根 据 微 卫 星 序 列 两 段 互 补 序 列 设 计 引 物，通 过 P C R 反 应 扩 增 微 卫 星 片 段。由 于 核 心 序 列 串 联 重 复 数 目 不同 造 成 了 品 种 间 的 多 态 性，通 过 P C R 的 方 法 扩 增 出 不 同 长 度 的 扩 增 产 物，将 扩 增 产 物 进 行 凝 胶 电 泳，在电 场 作 用 下 由 于 分 子 量 大 小 不 同 而 分 离，再 经 硝 酸 银 染 色，可 辨 别 S S R 电 泳 图 谱。S S R 分 子 标 记 呈 共 显性，选 用 品 种 间 具 有 多 态 性 的 S S R 引 物，杂 交 种 F 1 代 种 子 的 D N A-P C R 扩 增 产 物 谱 带 中 应 具 有 双 亲 谱 带，以 此 鉴 定 甜 瓜 杂 交 种 种 子 纯 度。5 仪 器 设 备 及 试 剂仪 器 设 备 及 试 剂 见 附 录 A。6 溶 液 配 制溶 液 配 制 方 法 见 附 录 B。7 引 物引 物 相 关 信 息 见 附 录 C。8 操 作 程 序8.1 样 品 准 备取 2 0 0 粒 种 子，催 芽。8.2 D N A 提 取8.2.1 总 则D N A 提 取 方 法 应 保 证 提 取 的 D N A 质 量 符 合 P C R 扩 增 的 要 求，D N A 溶 解 液 的 紫 外 光 吸 光 度 O D 2 6 0 与O D 2 8 0 的 比 值 应 介 于 1.8 2.0 之 间。D N A 提 取 可 任 选 8.2.2 与 8.2.3 中 的 一 种 方 法。其 中 改 良 C T A B 法 提 取 量 大，质 量 好，可 长 期 保 存；碱裂 解 法 简 单 快 速，但 提 取 量 小，质 量 一 般，不 宜 保 存。8.2.2 改 良 C T A B 法 提 取 D N A：a)将 样 品 置 于 2.0 m L 离 心 管，液 氮 冷 冻 后，迅 速 研 磨 成 粉 末；b)加 入 8 0 0 L 2%的 C T A B，混 合 均 匀 后，6 5 C 水 浴 3 0 m i n，每 1 0 m i n 轻 轻 上 下 摇 晃 5 1 0 次；D B 6 5 2 1/T 0 7 4 2 0 2 43c)加 入 8 0 0 L 的 氯 仿 异 戊 醇 为 2 4 1 的 混 合 液，上 下 颠 倒 2 0 0 次；d)8,0 0 0 r p m 离 心 1 0 m i n，抽 取 上 清 液 到 一 个 新 的 离 心 管 中；e)加 入 2/3 体 积 的 异 丙 醇，上 下 颠 倒 2 0 0 次，混 匀；f)1 2,0 0 0 r p m 离 心 1 0 m i n，此 时 D N A 成 白 色 团 装 聚 于 管 底，弃 去 上 清；g)用 7 5%乙 醇 洗 涤 2 次，最 后 一 次 用 移 液 枪 吸 干 管 底 的 多 余 酒 精，然 后 放 置 在 超 净 台 中 吹 干 水分；h)加 入 5 0 L 含 有 R N a s e 的 d d H 2 O 溶 解 D N A，放 置 在 4 C 备 用。8.2.3 碱 裂 解 法 提 取 D N Aa)将 种 子 嫩 芽 取 下，装 入 2 m L 离 心 管，同 时 放 2 颗 小 钢 珠；b)加 1 0 0 L N a O H（0.1 m o l/L）溶 液，用 高 通 量 组 织 研 磨 器 打 碎 样 品；c)然 后 将 离 心 管 置 于 沸 水 中 1 m i n，冷 却 后 加 入 1 0 0 L T r i s 缓 冲 液（1 0 0 m m o l/L，p H 8.0），充 分混 匀 备 用。取 1.5 3 L 作 为 P C R 反 应 模 板 D N A 进 行 P C R 扩 增。注：嫩 叶 D N A 提 取 用 C T A B 法；种 芽 D N A 提 取 采 用 碱 裂 解 法。8.3 P C R 扩 增8.3.1 反 应 体 系P C R 反 应 体 系（共 2 0 l）：6.4 L d d H 2 O；1 0 L M i x f o r P A G E；0.6 L 上 下 游 混 合 引 物（1 0 m o l/L）；3 L 模 板 D N A。8.3.2 反 应 程 序9 4 预 变 性 5 m i n；9 4 变 性 3 0 s，5 5 6 0 退 火 1 5 s，7 2 延 伸 1 5 s，3 6 个 循 环；7 2 延 伸 4m i n；4 保 存。8.4 P C R 产 物 检 测S S R-P C R 扩 增 产 物 采 用 8%的 非 变 性 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 进 行 检 测。电 泳 分 离 的 S S R-P C R 扩 增 片段 用 银 染 法 染 色。8.4.1 凝 胶 制 备蘸 取 洗 洁 精 用 清 水 将 玻 璃 板 反 复 擦 洗 干 净，再 用 去 离 子 水 冲 洗 后 晾 干；将 前 后 两 块 玻 璃 板 用 铁 夹固 定 好，将 一 定 体 积 的 8%非 变 性 聚 丙 烯 酰 胺 溶 液 中 加 入 0.5%体 积 的 1 0%过 硫 酸 铵 溶 液 和 0.1%体 积 的T E M E D，充 分 混 匀 后，立 即 灌 胶 至 玻 璃 胶 室，灌 胶 过 程 防 止 气 泡 产 生。灌 满 胶 后，及 时 将 样 品 梳 插 入其 中，待 胶 凝 固 后 使 用。8.4.2 电 泳待 凝 胶 凝 固 后，将 玻 璃 板 用 铁 夹 固 定 到 电 泳 槽 上，加 入 0.5 T B E 电 泳 缓 冲 液，中 间 的 液 面 应 没 过D B 6 5 2 1/T 0 7 4 2 0 2 44内 侧 的 导 电 丝，底 部 的 液 面 应 超 过 电 泳 槽 的 1/2（电 泳 缓 冲 液 可 反 复 使 用 多 次，一 般 一 周 更 换 一 次），拔 出 样 品 梳。每 一 个 加 样 孔 点 入 2 5 L P C R 扩 增 产 物 样 品，连 接 电 极，设 置 电 压 1 5 0 V，电 流 5 0 0 m A，一 般 电 泳 1 h 左 右（指 示 剂 到 达 胶 板 中 下 部 即 可）停 止 电 泳，关 闭 电 源。8.4.3 染 色取 下 玻 璃 板，轻 轻 撬 开，将 凝 胶 从 玻 璃 板 上 剥 离，浸 入 固 定 液 中，置 于 摇 床 上 摇 动 两 次，每 次 6 m i n；固 定 结 束 后，倒 掉 固 定 液，加 入 0.2%硝 酸 银 染 色 液，置 于 摇 床 轻 轻 摇 动，染 色 1 2 m i n；倒 去 染 色 液 后，先 加 入 适 量 的 硫 代 硫 酸 钠 溶 液（或 去 离 子 水）清 洗 3 0 s，倒 掉 后 再 用 适 量 去 离 子 水 漂 洗 3 0 s 后 倒 掉；在新 配 制 的 显 影 液 中 摇 动 至 出 现 清 晰 的 条 带；可 在 胶 片 灯 上 直 接 记 录 或 用 相 机 拍 照 保 存。注：固 定 液、染 色 液，去 离 子 水 和 显 影 液 的 用 量，可 依 据 胶 板 数 量 进 行 调 整，以 没 过 胶 面 为 准。8.5 S S R 扩 增 图 谱 的 判 读对 甜 瓜 S S R 图 谱 进 行 数 据 记 录 时，采 用 每 对 引 物 在 不 同 品 种 中 扩 增 的 整 体 带 型 为 单 位 进 行 数 据 记录。在 进 行 甜 瓜 品 种 纯 度 鉴 定 时，可 根 据 每 个 单 株 材 料 扩 增 出 的 整 体 带 型，比 对 2 0 0 个 单 株 整 体 带 型 差异。由 于 S S R 引 物 呈 共 显 性，合 适 的 S S R 引 物 P C R 扩 增 产 物 谱 带 具 有 双 亲 的 条 带。9 甜 瓜 杂 交 种 纯 度 计 算以 合 适 的 S S R 引 物 扩 增 送 检 样 品 的 D N A，通 过 带 型 统 计，用 具 有 本 品 种 特 异 带 型 的 送 检 样 品 数 占总 检 测 样 品 数 的 百 分 率 表 示 纯 度，计 算 公 式 如 下：C=T NT 1 0 0%（1）式 中：C 品 种 纯 度，单 位 为%；T 供 检 样 品 总 数，单 位 为 个；N 非 本 品 种 供 检 样 品 数，单 位 为 个。1 0 记 录 与 档 案应 对 整 个 试 验 过 程 进 行 详 实 记 录，记 录 档 案 至 少 保 存 两 年，做 到 可 追 溯。D B 6 5 2 1/T 0 7 4 2 0 2 45附 录 A（规 范 性 附 录）主 要 仪 器 设 备 及 试 剂A.1 主 要 仪 器 设 备A.1.1 水 浴 锅A.1.2 P C R 仪A.1.3 电 泳 仪A.1.4 垂 直 电 泳 槽 及 配 套 的 制 胶 附 件A.1.5 高 速 冷 冻 离 心 机A.1.6 水 平 摇 床A.1.7 电 子 天 平A.1.8 制 冰 机A.1.9 磁 力 搅 拌 器A.1.1 0 冰 箱A.1.1 1 紫 外 分 光 光 度 计A.1.1 2 高 通 量 组 织 研 磨 仪A.1.1 3 通 风 橱A.1.1 4 微 波 炉A.1.1 5 凝 胶 成 像 仪A.1.1 6 p H 计A.1.1 7 移 液 枪A.1.1 8 胶 片 观 察 灯A.2 主 要 试 剂A.2.1 无 水 乙 醇A.2.2 三 氯 甲 烷A.2.3 氢 氧 化 钠A.2.4 丙 烯 酰 胺A.2.5 过 硫 酸 铵（A P S）A.2.6 冰 醋 酸A.2.7 硝 酸 银A.2.8 琼 脂 糖A.2.9 M i x f o r P A G EA.2.1 0 去 离 子 水A.2.1 1 d d H 2 OA.2.1 2 硼 酸A.2.1 3 引 物A.2.1 4 十 六 烷 基 三 乙 基 溴 化 铵（C T A B）A.2.1 5 异 丙 醇A.2.1 6 甲 叉 丙 烯 酰 胺D B 6 5 2 1/T 0 7 4 2 0 2 46A.2.1 7 硫 代 硫 酸 钠（N a 2 S 2 O 3）A.2.1 8 甲 醛A.2.1 9 四 甲 基 二 乙 胺（T E M E D）A.2.2 0 D N A M a r k e rA.2.2 1 异 戊 醇A.2.2 2 氯 化 钠A.2.2 3 T r i s 碱A.2.2 4 4 0%A c r-B i sA.2.2 5 T r i s-H C lD B 6 5 2 1/T 0 7 4 2 0 2 47附 录 B（规 范 性 附 录）溶 液 配 制B.1 D N A 提 取B.1.1 0.5 m o l/L E D T A 溶 液称 取 1 8.6 1 g N a 2 E D T A H 2 O，溶 解 于 7 0 m L d d H 2 O 中，定 容 至 1 0 0 m L，p H 调 至 8.0，高 温 灭 菌。B.1.2 1 m o l/L T r i s-H C l 溶 液称 取 1 2.1 g T r i s 碱 溶 解 于 8 0 m l d d H 2 O 中，d d H 2 O 定 容 至 1 0 0 m L，调 节 p H 至 8.0。B.1.3 C T A B 提 取 液称 取 4.0 g C T A B、1 6.3 6 4 g N a C l、量 取 2 0 m L 的 1 m o l/L T r i s-H C l（p H=8.0）、8 m L 的 0.5 m o l/L E D T A、7 0 m L 的 d d H 2 O 震 荡 摇 匀，定 容 至 2 0 0 m L，高 温 高 压 灭 菌 3 0 m i n，冷 却 后 置 于 阴 凉 干 燥 处 备 用。B.1.4 0.1 m o l/L N a O H2 g N a O H，加 d d H 2 O 定 容 至 5 0 0 m L。B.1.5 0.1 m o l/L T r i s 缓 冲 液1 2.1 g T r i s，加 d d H 2 O 定 容 至 1 0 0 0 m L，调 节 p H 至 8.0。B.2 P C R 扩 增B.2.1 M i x f o r P A G E成 品（M i x f o r P A G E）。B.2.2 引 物用 d d H 2 O 按 照 说 明 分 别 配 制 正 向 引 物、反 向 引 物 使 其 终 浓 度 均 为 2 0 m o l/L 的 储 存 液，等 体 积 混 合 成1 0 m o l/L 的 工 作 液。B.3 电 泳B.3.1 5 0 T A E（5 0 0 m L）D B 6 5 2 1/T 0 7 4 2 0 2 481 2 1 g T r i s、N a 2 E D T A H 2 O 1 8.6 g 或 0.5 m o l/L E D T A（5 0 m L）、4 0 0 m L 去 离 子 水、2 8.5 5 m L 冰 乙 酸，调 p H=8.3，定 容 至 5 0 0 m L。B.3.2 1 0 T B E（1 0 0 0 m L）1 0 8 g T r i s、5 5 g 硼 酸、3 7.2 5 m L E D T A N a 2，d d H 2 O 定 容 至 1 0 0 0 m L。B.3.3 4 0%A c r-B i s丙 烯 酰 胺-甲 叉 双 丙 烯 酰 胺 按 质 量 比 1 9:1 配 制。B.3.4 T E M E D成 品（四 甲 基 二 乙 胺）。B.3.5 1 0%A P S2 0 g 过 硫 酸 铵 加 d d H 2 O 定 容 至 2 0 0 m L（4 0 0 L 分 装，2 0 保 存）。B.3.6 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶每 块 胶 的 配 制（总 体 积：4 0 m L）：2 8 m L d d H 2 O、4 m L 1 0 T B E、8 m L 4 0%A c r-B i s、4 0 L T E M E D、4 0 0 L 1 0%A P S。B.4 染 色B.4.1 固 定 液5 0 m L 无 水 乙 醇、2.5 m L 冰 醋 酸，加 d d H 2 O 至 5 0 0 m L。B.4.2 染 色 液1 g A g N O 3，加 d d H 2 O 至 5 0 0 m L。B.4.3 清 洗 液1 2 0 L 1 0%N a 2 S 2 O 3，加 d d H 2 O 至 5 0 0 m L。B.4.4 显 影 液7.5 g N a O H、1.5 m L 甲 醛，加 d d H 2 O 至 5 0 0 m L。D B 6 5 2 1/T 0 7 4 2 0 2 49附 录 C（规 范 性 附 录）核 心 引 物表 C.1 核 心 引 物序 号 名 称 正 向 引 物(5-3)反 向 引 物(5-3)1 S S R 1 2 0 8 3 G A A T T G G C C C A T C C T T C A T T G C C A T T C C A A A A A C T T T T C A A C2 M U 5 5 5 4-1 C C T T C A T G A T C C T C T A C T A A A C C C T C T T C C A T G C T T T T C T C G C T3 T J 1 0 A C G A G G A A A A C G C A A A A T C A T G A A C G T G G A C G A C A T T T T T4 P M 3 T C A A C T G T C C A T T T C T C G C T G C C G T A A A G A C G A A A A C C C T T C5 M U 5 4 9 9 A A G A A G A A A G T T C C C C T C T C G C G A C T G T G T C T T G T G G A G G A6 S S R 0 4 2 1 9 G A G A C A T T G T G G G C A T T T G A C T C A T T T T C A T C C A A A G G G C7 S S R 0 4 6 3 2 A C T C C G T T T G G T G G T T T T T G T C C C A A T T C C A T A G C A G A G G8 S S R 2 2 8 7 4 C A A C C C C C A A G C T C T G A T A A A T T G G A G A G T G C T A T T G G G G9 C 3 0 C T G T C T G C T A T T C T C C A C T T G G T G T A T G C C A C G T A G C G A A A C