牛无绿藻PCR-RFLP检测技术DB42／T 2252-2024.pdf

ICS 65.020.30 CCS B 41 DB42 湖北省地方标准 DB42/T 2252 2024 牛无绿藻PCR-RFLP 检测技术 PCR-RFLP detection technique for Prototheca bovis 2024-07-29 发布 2024-09-29 实施 湖 北 省 市 场 监 督 管 理 局 发 布 DB42/T 2252 2024 I 目 次 前言.III 1 范围.1 2 规 范性 引用 文件.1 3 术 语和 定义.1 4 缩 略语.1 5 实 验原 理.2 6 仪 器设 备.2 7 试 剂和 材料.2 8 样 品的 制备.3 9 检 测步 骤.4 10 结 果判 定.5 11 实 验室 生物 安全 要求.6 12 标 准实 施及 评价.6 附录A（资 料性）湖北 省地方 标准 实施 信息 及意 见反馈 表.8 DB42/T 2252 2024 III 前 言 本文件 按照GB/T 1.1 2020 标 准化 工作 导则 第1 部分：标准 化文 件的 结构 和起草 规则 的 规 定起草。请注意 本文 件的 某些 内容 可能涉 及专 利。本文 件的 发布机 构不 承担 识别 专利 的责任。本文件 由 武 汉市 农业 科学 院提出。本文件 由 湖 北省 农业 农村 厅 归口。本文件 起草 单位：武 汉市 农业科 学院、华 中农 业大 学。本文件 主要 起草 人：陈夏 冰、陈 洁、胡长 敏、丁一、邵志 勇、吴利 军、丁明 星、万 平民、何 斌、金尔光、杨文 海、童伟 文、王肆玖、周 源。本文件 实施 应用 中的 疑问，可咨询 湖北 省农 业农 村厅，电话：027-87665821，邮 箱：；或者牵 头起 草单 位 武 汉市 农业科 学院，联 系电 话：027-81776359，邮 箱：。对 本 文 件 的 有 关 修 改 意 见 建 议 请 反 馈 至 武 汉 市 农 业 科 学 院，联系电 话：027-81776359，邮箱：。DB42/T 2252 2024 1 牛 无绿 藻PCR-RFLP 检测 技术 1 范围 本文件 规定 了牛 无绿 藻PCR-RFLP 检测 技术 所涉 及的 实 验原理、仪器 设备、试剂 和 材料、样 品 的 制备、检测步 骤、结果 判定 等技 术标准。本文件 适用 于生 鲜乳 中牛 无绿藻 的定 性检 测、实验 室诊断。2 规范性 引用 文件 下列文 件中 的内 容通 过文 中的规 范性 引用 而构 成本 文件必 不可 少的 条款。其 中，注日 期的 引用 文件，仅该日 期对 应的 版本 适用 于本文 件；不注 日期 的引 用文件，其 最新 版本（包 括所有 的修 改单）适 用 于 本文件。GB 4789.2 食 品安 全国 家 标准 食品 微生 物学 检验 菌落 总数 测定 GB/T 6682 分 析实 验室 用 水 规格 和试 验方 法 GB 19489 实验 室 生物 安 全通用 要求 NY/T 541 兽医 诊断 样品 采集、保存 与运 输技 术规 范 SN/T 3902 检 验检 疫二 级 生物安 全实 验室 通用 要求 3 术语和 定义 下列术 语和 定义 适用 于本 文件。牛无绿 藻 Prototheca bovis 一种真 核生 物，绿藻 纲，绿藻门，共 球藻 纲，小 球 藻目，小球 藻科，无绿 藻 属，能 够引 起奶 牛乳 腺炎。4 缩略语 下列缩 略语 适用 于本 文件。P.bovis：牛无 绿藻（Prototheca bovis）DNA：脱氧 核糖 核酸（DeoxyriboNucleic Acid）PIM：无绿 藻分 离培 养基（Prototheca Isolation Medium）TSB：胰蛋 白胨 大豆 肉汤 培 养基（Tryptone Soybean Broth Medium）PCR：聚合 酶链 式反 应（Polymerase Chain Reaction）PCR-RFLP：限制 性片 段长 度多态 性聚 合酶 链反 应（Restriction Fragment Length Polymorphism PCR）PBS：磷酸 盐缓 冲液（Phosphate Buffer Saline）TAE：三乙 醇胺 四乙 酸缓 冲 液（Tris-acatate-ethylene Diamine Tetraacetic Acid Buffer）DB42/T 2252 2024 2 cytb：细胞 色素b（cytochrome b）5 实验原 理 cytb 基 因在 牛 无绿 藻 中 相 对保守，通过 对 牛 无绿藻cytb 基因 序列 的进行 分析，设计了 特异性PCR 引物，可 扩增 牛无 绿藻，然 后通过 特异 性的 限制 性酶 切反应，鉴 定牛 无绿 藻。6 仪器设 备 仪器设 备包 括但 不限 于：a)超净工 作台；b)高速冷 冻离 心机；c)恒温震 荡培 养箱；d)冰箱；e)PCR 仪；f)凝胶成 像仪；g)电泳仪；h)水浴锅；i)单道微 量移 液器（0.5 L 10 L、10 L50 L、20 L200 L、100 L 1000 L 等规格）。7 试剂和 材料 试剂 7.1.1 培养基 和样 品制 备：PIM 配制 见表 1、TSB 配制 见表 2。PIM 配制 按表 1 中成 分溶 解于蒸 馏水 中，pH 5.1 0.1，121 高压 灭菌 15 min。TSB 配制 按表 2 中 成分 溶解 于蒸 馏水 中，pH 7.3 0.2，121 高压灭 菌15 min。表1 PIM 配制 表 成分 g/L 邻苯二甲酸氢钾 10.0 氢氧化钠 0.9 硫酸镁 0.1 磷酸二氢钾 0.2 氯化铵 0.3 葡萄糖 10.0 盐酸硫胺素 0.001 琼脂 20.0 5-氟胞嘧啶 0.25 DB42/T 2252 2024 3 表2 配制 表 成分 g/L 酪蛋白胰酶消化物 17 大豆粉木瓜蛋白酶消化物 3 氯化钠 5 磷酸氢二钾 2.5 葡萄糖 2.5 7.1.2 PCR 试 剂：2 Taq Master Mix 试剂 盒，可使 用其 他效果 相似 商品 化试 剂盒。7.1.3 电泳相 关试 剂：TAE、琼 脂 糖、Gel Red 荧 光染 料、DL500 DNA Maker、DL2000 DNA Maker。7.1.4 限制性 内切 酶试 剂：Tai I 和Rsa I 快切 酶，可使 用其他 效果 相似 商品 化限 制性内 切酶。7.1.5 阳性对 照：含有 牛无 绿 藻cytb 基因 序列 的重 组 pMD18-T 载 体（20 ng/mL）。7.1.6 阴性对 照：无菌 双蒸 水（符合GB/T 6682 中的 二 级 水质要 求）。引物 上游引 物:5-gtgtagaacatattatgagag-3 下游引 物:5-tacccataagaaataccattctgg-3 材料 材料包 括但 不限 于：a)离心管（1.5 mL，200 L）；b)PCR 反应 管；c)移液器 吸头（1 mL，200 L，10 L）。8 样品的 制备 样品的 采集 生鲜乳 样品 按照NY/T 541 中乳汁 样品 采集 技术 进行 操作，4 保存。样 品立 即 送至实 验室，按 照GB 4789.2 进行 样品 的稀 释。然后，将100 L 样品 均匀 地 涂布在PIM 平板 上，并 在37 下培 养48 h72 h，选择白色 奶油 样凸 起的 单个 菌落进 行继 代培 养和 纯化。样品 的 培养 挑取纯 化的 牛无 绿藻 单菌 落样品 接种 在10 mL TSB 培 养基中，置 于37，180 rpm，恒 温震 荡培 养箱中培养36 h 48 h，培养 液OD600 值在2 3 之间。样品 的 制备 取8.2 中1 mL 培 养液 放入1.5 mL 灭 菌 离 心管 中，10000 rpm 离心2 min，弃 掉上 清，加 入1.0 mL无 菌的PBS，涡旋混 匀，10000 rpm 离心2 min，弃掉 上清，收 集沉 淀 样品于1.5 mL灭 菌离 心管 中。样品的 存放 收集的 样品放 置于 冰上 或 者2 8 条 件下 保存，尽快进 行检测。制 备的 样 品在2 8 条件 下保存应 不超 过24 h；若需 长 期保存，应 置于-80 冰 箱 保存。DB42/T 2252 2024 4 9 检测步 骤 牛无绿 藻DNA 的提 取 将8.4 样品 中加 入1 mL 无菌 双蒸水，用 涡旋 振荡 器震 荡均匀。95 水浴15 min，12000 rpm 离心5 min，吸取上 清，冰上或 者2 8 条件 下保 存，尽 快进 行 检测。制备的 样品 在2 8 条件 下保 存应不 超过24 h；若 需长 期保 存，应 置于-80 冰箱 保存，避 免 反复冻 融。PCR 扩 增体 系配 制 PCR扩 增反 应体 系配 制见 表3。表 中 引物 使用 浓度 为10 mol/L，阳 性对 照和 待 检样品 均需 稀释20倍后作 为模 板使 用；取PCR 反应管，基于 样本 数量 进 行编号；将表3的 反应 体系（不含模 板）充 分混 匀后，每个反 应管 中加 入45 L 反 应液；取5 L阴 性对 照、阳 性对照、待 检样 品模 板，分别加 入相 应编 号的 反应管中混 匀，放置 到PCR仪中。表3 PCR 扩 增反 应体 系 试剂 体系（L）无菌双蒸水 16 2 Taq Master Mix 25 上游引物 2 下游引物 2 模板 5 总体积 50 PCR 扩增 进行PCR 反 应。反 应程 序为：95 预变 性5 min；95 变性30 s，54 退火30 s，72 延伸30 s，35 个循环；72 终 延伸5 min；4 保存。PCR-RFLP 酶切 PCR-RFLP 酶 切反应 体系 配 制见表4。将表4的反 应体 系（不 含PCR 产物）充分 混 匀后，每个反 应管 中加入33 L 反应 液，并进 行 编号。分别 取17 L PCR 产 物，加 入相 应反 应管 中混 匀，放 置到 水浴 锅中，在37 下酶 切10 min（Rsa I，10 U/L），然后 在65 下酶切10 min（Tai I，10 U/L）。表4 酶切反 应体 系 试剂 体系（L）无菌双蒸水 23 PCR产物 17 限制性内切酶缓冲液 5 Tai I 快切酶 2.5 Rsa I 快切酶 2.5 总体积 50 DB42/T 2252 2024 5 电泳 PCR 产 物电 泳：配制1%琼 脂 糖凝胶，将1 g 琼脂 糖放 入100 mL 1 TAE 电 泳缓 冲液 中，加 热后 充分 溶解，待温度 降至50 左 右时，加入5 L 的Gel Red 荧光 染 色剂或 者按 照商 品说 明加 入其他 同等 效应 的染 料，混合后 铺板。5 L PCR 反 应产物，包 括被 检样 品、阳性对 照、阴性 对照；5 L的DL2000 DNA Maker，点样进行 琼脂 糖凝 胶电 泳。酶切产 物电 泳：配 制4%琼 脂糖凝 胶，将4 g琼 脂糖 放 入100 mL 1 TAE 电 泳缓 冲 液中，加 热后 充分 溶解，待温 度降 至50 左右 时，加入5 L的Gel Red 荧 光染色 剂，混 合后 制胶。取20 L酶 切反 应产 物，包括被检 样品、阳 性对 照和 阴性对 照；5 L的DL500 DNA Maker，点样 进行 琼脂 糖凝胶 电泳。凝胶成 像 电泳结 束后，用 凝胶 成像 仪观察 检测DNA 成像 结果，拍照，记录 结果。10 结果判 定 质控标 准 PCR 结果：牛无 绿藻阳性对照样品，PCR 扩 增产物经电泳后，出 现大小为644 bp 的特异性 扩增条带，阴性对 照无 任何 扩增 条带，符合 图1。图1 牛无绿 藻 PCR 鉴 定图 DB42/T 2252 2024 6 酶切结 果：牛无 绿藻 阳性 对照样 品，酶切 产物 经电 泳后，出现 大小 分别 为47 bp、161 bp、411 bp 的三条带，阴 性对 照无 条带，符合 图2。图2 牛无绿 藻PCR-RFLP 酶切 鉴 定图 质控结 果应 与上 述描 述一 致。结果判 定 样品PCR 扩增 未出现 特定 性 的阳性 扩增条 带或 酶切结 果未出 现与阳 性对 照大小 一致的 三条带，判 定为阴性；样 品PCR 扩 增出 现 大小为644 bp 特异 性阳 性 扩增条 带，且酶 切结 果出 现与阳 性对 照大 小一 致的三条带，判 定为 阳性。11 实验室 生物 安全 要求 实验室 应符 合SN/T 3902 要 求，实 验室 生物 安全 应符 合GB 19489 要求。12 标准实 施及 评价 本标准 公开 征求 意见 期间，收集 到行 业 内 15 家单 位的 15 位 专家 的回 执意 见，对 标准 草案 提 出94 条 修改意 见现 已根据 修 改意见 全部进 行了 修改或 说明，两家权 威单 位对本 标准的 方法验 证进 行了 验证，为 本方 案的 实施 做好 了切实 的准 备。本标准 的实 施，适 用于 生 鲜乳中 牛无 绿藻 的定 性检 测、实验 室诊 断，为 保证 试 验结果 的严 谨性 和准确性，样 品的 采集 应符 合 NY/T 541 乳 汁样 品采 集 技术要 求，实验 室环 境和 配套设 施应 符 合 SN/T 3902要求。针 对 标 准中 相 关 的样 品 采样 人 员 和实 验 室 人员 需 进行 标 准 的宣 贯 和 培训，详细 解 说 标准 各 章 条内容，确保 严格 按照 标准 要求操 作。牛无绿 藻在 全球 及我 国多 省广泛 流行，本标 准的 实 施，可以 对生 鲜乳 中 牛 无 绿藻进行 鉴 定，有 利于牛无 绿藻 的防 控，保障 公共卫 生安 全。依据 中华 人民 共和 国标 准化法，为对 本标 准实 施 进行 检查，相 关实 施人 员可将 本标准 实 施 应用中的 疑问 进 行逐 条记录，并联 系 牵头 起草 单位 武 汉市农 业科学 院，联系电 话：027-81776359，邮 箱：。DB42/T 2252 2024 7 牛无绿 藻的 传统 鉴定 方法 主要采 用以 培养 为基 础的 形态学 方法，但 具有 较强 的主观 性。本标准 针对牛无 绿藻 制定 了分 子生 物学检 测标 准，能够 精准 的检测 出 生 鲜乳 中的 牛无 绿藻，填补 了牛 无绿 藻 标 准检测的 空白。通 过样 品的 追 踪，对 患病 奶牛 进行 治疗 或 淘汰，提升 了生 鲜乳 品质，保障了 食品 质量 安全，降低了 的经济 损失，客户 满意度 高。本 标准 对样品 的制备 要求较 高，未来将 进一步 对本标 准进 行优化，补充完 善标 准方 案。标准实 施后，为及 时掌 握 标准实 施情 况，了 解地 方 标准实 施过 程中 存在 的问 题，并为 标准 复审 提供科学 依据，将 继续 收集 对本标 准的 意见 建议，并 及时向 专业 标准 化技 术委 员会和 湖北 省农 业农 村 厅 反馈情况。标准实 施信 息及 意见 反 馈 表相关 示例 见附 录 A。DB42/T 2252 2024 8 A A 附录A（资料 性）湖北省 地方 标准 实施 信息 及意见 反馈 表 湖北省 地方 标准 实施 信息 及意见 反馈 表如 表A.1 所示。表A.1 湖北省 地方 标准 实施 信息 及意见 反馈 表 标 准 名 称 及 编 号 牛无绿藻 PCR-RFLP 检测技术 总 体 评 价 适用性 该 标 准 与 当 前 所 在 地 的 产 业 或 社 会 发 展 水 平 是 否 相 匹 配？是 否 协调性 该 标 准 的 特 色 要 求 与 其 他 强 制 性 标 准 的 主 要 技 术 指 标、相关 法 律 法 规、部 门 规 章 或 产 业 政 策 是 否 协 调？是 否 执行 情况 标 准 执 行 单 位 或 人 员 是 否 按 照 标 准 要 求 组 织 开 展 相 关 工 作？是 否 实 施 信 息 标 准 实 施 过 程 中 是 否 存 在 阻 力 和 障 碍？是 否 实 施 过 程 中 存 在 的 主 要 问 题 修 改 意 见 总体 意见 适用 修改 废止 具 体 修 改意见 需 修 改 章 节：具体修改意见：反馈渠道 标准化行政主管部门 省直行业主管部门 专 业 标 准 化 技 术 委 员 会（工 作 组）标 准 起 草 组（牵 头 起 草 单 位）反馈人 姓名：单位：联系方式：填表说明：为及时掌握标准实施情况，了解地方标准实施过程中存在的问题，并为标准复审提供科学依据，特制定湖北省地方标准实施信息及意见反馈表。可根据实际情 况在表格中对应方框打勾，有需要文字说明的反馈意见可在相应位置进行文字描述，也可另附页。