香菇生产技术规程 第1部分：液体菌种DB42／T 192.1-2024.pdf

ICS 65.020.20 CCS B 39 DB 42 湖北省地方标准 DB42/T 192.1 2024 香菇生产 技术规程 第1 部分：液体菌 种 Code of practice for cultivation of Lentinula edodes Part 1：Liquid spawn 2024-07-29 发布 2024-09-29 实施 湖 北 省 市 场 监 督 管 理 局 发 布 DB42/T 192.1 2024 I 目 次 前言.III 引言.1 范围.1 2 规 范性 引用 文件.1 3 术 语和 定义.1 4 生 产条 件.2 5 生 产工 艺流 程.2 6 发 酵罐 液体 菌种（二 级 液体栽 培种）生 产技 术.4 7 发 酵罐 液体 菌种（三 级 液体栽 培种）生 产技 术.5 8 取 样检 测与 质量 要求.7 9 使 用方 法.7 10 标 签与 贮存.8 11 生 产档 案.8 附录A（资 料性）香菇 液体菌 种培 养基 配方.9 附录B（资 料性）香菇 液体菌 种生 产记 录事 项.10 参考文 献.11 DB42/T 192.1 2024 III 前 言 本文件 按照GB/T 1.1 2020 标 准化 工作 导则 第1 部分：标准 化文 件的 结构 和起草 规则 的 规 定起草。本文件 是DB42/T 192 香 菇生产 技术 规程 的 第1 部 分。DB42/T 192 已经 发 布 了以下 部分：第1 部 分：液体 菌种；第2 部 分：代料 香菇 秋栽 与贮藏 运输。请注意 本文 件的 某些 内容 可能涉 及专 利。本文 件的 发布机 构不 承担 识别 专利 的责任。本文件 由宜 昌市 农业 科学 研究院 提出。本文件 由湖 北省 农业 农村 厅归口。本文件 起草 单位：宜 昌市 农业科 学研 究院、华 中农 业大学、三 峡大 学、湖北 省农业 科学 院农 产品 加工与核 农技 术研 究所、湖 北森源 生态 科技 股份 有限 公司、宜昌 银罡 桑蚕 科技 股份有 限公 司。本文件 主要 起草 人：胡光 灿、冯 德品、朱 红、刘世 玲、申 露露、夏 辉、周刚、李克 彬、杨青、边 银丙、沈 祥陵、周 伟、高新 章、焦 海涛、史 德芳、闵 维清、肖成。本文件实施应用中的疑问，可咨 询 湖 北 省 农 业 农 村 厅，联 系 电 话：027-87665821，邮 箱：；对 本 文 件 的 有 关 修 改 意 见 建 议 请 反 馈 至 宜 昌 市 农 业 科 学 研 究 院，联 系 电 话：0717-6671431，邮箱：。DB42/T 192.1 2024 V 引 言 香菇是 我国 传统 的食 用菌 人工栽 培品 种，栽培 历史 悠久，市场 需求 巨大。香 菇产业 作为 见效 快、收益高，绿色 环保 可循 环的 富民产 业也 得到 了各 级政 府和广 大农 民的 青睐，香 菇种植 效益 显著 高于 普 通 粮油作物，大 力发 展香 菇产 业是促 进农 业增 效、农民 增收的 有力 举措，是 实现 乡村振 兴的 有效 途径。我 省随州、宜昌、十 堰等 地香 菇栽培 量大、产 量高，取 得了非 常好 的经 济效 益和 社会效 益。制定 本文 件 的 目的，是构 建香 菇栽 培管 理 全过程 标准 体系，实现 香 菇标准 化生 产。本 文件 不 同部分 的划 分和 技术 规程 的确 立，重点 为 香菇 整 个生产 过 程 中不 同 生产 环 节的技 术 要 求，亦 便于 本 文件各 部 分 单独 使 用。DB42/T 192拟 由 以 下部 分构 成。第1 部 分：液体 菌种。目 的在于 规范 香菇 液体 菌种 生产技 术。第2 部 分：代料 香菇 秋栽 与贮藏 运输。目 的在 于规 范代料 香菇 秋栽 及贮 藏运 输技术。DB42/T 192.1 2024 1 香 菇生产 技术规程 第 1 部分：液体菌 种 1 范围 本文件 规定 了香 菇（Lentinula edodes）液 体菌 种的 生产条 件、生产 工艺 流程、生产 技术、留 样 检测与质 量要 求和 使用 方法、标签 与贮 存以 及生 产档 案等。本文件 适用 于湖 北省 香菇 液体菌 种的 生产。2 规范性 引用 文件 下列文 件中 的内 容通 过文 中的 规 范性 引用 而构 成本 文件必 不可 少的 条款。其 中，注日 期的 引用 文件，仅该日 期对 应的 版本 适用 于本文 件；不注 日期 的引 用文件，其 最新 版本（包 括所有 的修 改单）适 用 于 本文件。GB 5749 生活 饮用 水卫 生 标准 GB 19170 香菇 菌种 GB 50073 洁净 厂房 设计 规范 NY/T 528 食用 菌菌 种生 产技术 规程 NY/T 1284 食 用菌 菌种 中 杂菌及 害虫 的检 验 NY/T 1742 食 用菌 菌种 通 用技术 要求 3 术语和 定义 GB/T 12728 界定 的以 及下 列术语 和定 义适 用于 本文 件。液体菌 种 liquid spawn 生长在 液体 培养 基里 的菌 种。来源：GB/T 12728-2006,2.5.30 摇瓶液 体菌 种 liquid spawn in shake flask 由母种 接种 到锥 形瓶 液体 培养基 中在 摇床 上振 荡扩 大培养 而成 的菌 丝体 纯培 养物。发酵罐 液体 菌种（二 级液 体栽培 种）liquid spawn in fermentation tank（secondary liquid spawn）由母种 接种 到发 酵罐 液体 培养基 中扩 大培 养而 成的 菌丝体 纯培 养物。发酵罐 液体 菌种（三 级液 体栽培 种）liquid spawn in fermentation tank（tertiary liquid spawn）由发酵 罐液 体菌 种（二级 液体栽 培种）接 种到 发酵 罐中扩 大培 养而 成的 菌丝 体纯培 养物。DB42/T 192.1 2024 2 4 生产条 件 人员条 件 按照 湖 北省 食用 菌菌 种 管理办 法 的 规定 配备 液 体菌种 生产 的专 业技 术人 员，熟悉 液体 菌种 生产和设备 设施 的操 作。场地条 件 场地选 择应 符合NY/T 528 的要求。厂房要 求 厂房设 置与 布局 符合NY/T 528 要 求。生产 车间 应按 照GB 50073 执 行，培养 基配 制室、摇 瓶液体 菌种培养室、液体 菌种 生产 车 间规模 配套，培养 基配 制 室保持 干净 整洁，并且 和 摇瓶液 体菌 种培 养室 以及 液体菌种 发酵 车间 分隔 开。生产设 备与 设施 设备与 设施 符合NY/T 528 要求，公用 工程 系统 有水 处理系 统、循环 水系 统、蒸汽系 统、冰水 系统、无菌压 缩空 气系 统和 应急 电源。高 压蒸 汽灭 菌锅、蒸 汽锅炉 等压 力容 器应 经政 府有关 部门 检验 合格，符合监管 部门 要求。5 生产工 艺流 程 流程见 图1。DB42/T 192.1 2024 3 注1：发酵罐液体菌种（二级液体栽培种）生产 注2：发酵罐液体菌种（三级液体栽培种）生产 图1 香菇液 体栽 培种 生产 工艺 流程 DB42/T 192.1 2024 4 6 发酵罐 液体 菌种（二 级液 体栽培 种）生产 技术 品种选 择 使用经 本地3年 以上 多点 试 验，适 合液 体发 酵、传 代稳 定、品 质优、抗逆 性强、产 量高的 香菇 品种。菌种质 量应 符合GB 19170 和NY/T 1742 规 定的 要求。制备母 种 符合NY/T 528 要 求。摇瓶液 体菌 种生 产 6.3.1 容器标 准 采用1000 mL 2000 mL 的 锥 形瓶，锥形 瓶应 保持 清洁、干燥。6.3.2 装液量 按照锥 形瓶 容积 的40%装 量 系数装 液，用带 有透 气功 能的封 口膜 封口。6.3.3 摇瓶液 体菌 种培 养基 配方 见附录A中 培养 基配 方A.1。6.3.4 灭菌 高压蒸 汽灭 菌，在121，0.11 MPa 0.12 MPa 的压 力 下，维 持30 min。6.3.5 接种 将灭菌 后装 有培 养基 的锥 形瓶冷 却至25 以下 进行 接种，拿出 已活 化好 的平 板母种，在 无菌 环境 下打孔接 种，每瓶 接入 直径0.5 cm 的菌 块3块5 块。6.3.6 培养 将接种 后的 锥形 瓶放 到摇 床上进 行避 光振 荡培 养，保 持温度2325，转速150 r/min 170 r/min，培养6 d8 d。发酵罐 液体 菌种（二 级液 体栽培 种）生产 6.4.1 生产前 的检 查及 清洗 检查生 产线 上全 部阀 门、安全阀、压 力表，要求 完 好，工 作正 常。对 所有 罐 体、管 道和 阀门 用清 洁的流水 进行 清洗，达 到无 死角、内壁 无培 养料 等残 余物。6.4.2 生产线 空消 生产线 在初 次使 用、长 期 未使用、上一 次发 酵生 产 出现染 菌或 者更 换生 产品 种时，应 清洗 干净 并进行空消 灭菌。将蒸 汽通 入 生产线 所有 设备 和管 道，对发酵 罐以 及各 路阀 门、管道及 相关 附件 进行 彻底 灭菌，蒸 汽压 力为0.1 MPa 0.15 MPa、温度121 124、灭菌30 min 40 min。6.4.3 液体菌 种培 养基 配制 DB42/T 192.1 2024 5 具体配 方根 据原 料来 源和 营养需 求，使用 适宜 的配 方，用 水应 符合GB 5749 要 求。常 用的 配方 见 附录A.2。在 配料 罐中 将培 养 基按配 方用 水混 合好，混 合好的 培养 基体 积小 于发 酵罐装 量系 数体 积。6.4.4 投料与 定容 配制好 的培 养基 通过 管道 和离心 泵投 入发 酵罐，用 水定容 至发 酵罐 罐体 容量 的70%，加 入0.03%消泡剂，通 入压 缩空 气搅 拌2 min 3 min，混 合均 匀。6.4.5 发酵罐 实消 通入蒸 汽将 发酵 罐及 投入 的培养 基进 行灭 菌，保持 罐内温 度121，维 持60 min。6.4.6 冷却 灭菌结 束后，通 过发 酵冷 却 系统，使罐 内培 养基 降温 至2426。保 持压 力平 稳，防止 罐压 回零。6.4.7 接种 发酵罐 接种口 处放 置百级 层流罩，用带 有手 柄的接 种火焰 圈，蘸 上95%的酒 精，套在 接种口 上点 燃火焰圈，在火 焰上 方打开 摇瓶液 体菌种 瓶塞，用火 焰灼烧 瓶口30 s 40 s，打 开发酵 罐上的 接种 口盖，将摇瓶 液体 菌种 快速 倒入 发酵罐 中，迅速 盖好 并拧 紧接种 口，开始 发酵 生产。6.4.8 碳源、氮源 流加 罐准 备 将碳源 流加 罐和 氮源 流加 罐以及 附属 的阀 门管 道等 先空消 灭菌，加 入碳 源（糖蜜原 液）和氮 源（8%的食品 级氨 水）后再 实消 灭菌，在发 酵培 养阶 段根 据自控 系统 调节 使用。6.4.9 碱液、消泡 剂流 加罐 准备 将碱液 罐和消 泡剂 罐以及 附属的 阀门管 道等 先空消 灭菌，分别加 入碱 液(饱 和 碳酸钠 溶液）和消 泡剂（0.09%的 聚氧 乙烯聚 氧 丙烯季 戊四醇 醚）再实消 灭菌，在液体 菌种 发酵培 养阶段 根据需 求，通过 自控系统 调节 使用。6.4.10 培养条 件 发酵罐 温度 保持 在23 25；培养 基初 始pH 5，整 个发酵 过程 设定 为pH 4.5；发 酵罐 罐内压 力保持在0.02 MPa 0.04 MPa；通过 发酵 罐的 进气 阀和 排气阀 将通 风量 调节 至1 0.5 V/V 11.2 V/V(料液体积/空 气体 积)。6.4.11 培养时 间 培养时 间为6 d 8 d。6.4.12 放罐指 标 经镜检 和其 他理 化指 标等 方法检 验质 量合 格，符合 表1规定 即 可放 罐接 种。7 发酵罐 液体 菌种（三 级液 体栽培 种）生产 技术 发酵罐 选择 DB42/T 192.1 2024 6 发酵罐 液体 菌种（三级 液 体栽培 种）生 产的 发酵 罐 体积大 小根 据生 产需 求量 进行选 择，按 照发 酵罐装量体 积8%10%的 接种 量 进行接 种，合 理配 置二级 液体栽 培种生 产发 酵罐的 体积和 数量，根据 接种 量设置1 个二 级液 体栽 培种 生 产的发 酵罐 对1 个5 个三 级液体 栽培 种生 产的 发酵 罐。生产前 的检 查及 清洗 按照 本 文件6.4.1 的 规定 执行。空消 按照 本 文件6.4.2 的 规定 执行。液体菌 种培 养基 配方 和配 制 按照 本 文件6.4.3 的 规定 执行。投料与 定容 按照 本 文件6.4.4 的 规定 执行。发酵罐 实消 按照 本 文件6.4.5 的 规定 执行。冷却 按照 本 文件6.4.6 的 规定 执行。接种 打开三 级液体 栽培 种生产 发酵罐 接种口 阀门 和二级 发酵罐 出料口 阀门(这些 发 酵罐附 属设施 和两 个发酵罐 之间连 接的 管道在 空消、实消时 和接 种前都 应 进行 灭菌)，将二 级液 体 栽培种 生产的 液体 菌种，利用无 菌压 缩空 气的 压力，通过 管道 输送 到三 级液 体栽培 种生 产的 发酵 罐中，按照 发酵 罐培 养基 装 量 体积8%10%的接 种量 进行 接 种，接 种完 毕，拧紧 接种 口的阀 门，开始 进行 三级 液体栽 培种 生产。碳源、氮源 流加 罐准 备 按照 本 文件6.4.8 的 规定 执行。碱液、消泡 剂流 加罐 准备 按照 本 文件6.4.9 的 规定 执行。发酵罐 液体 菌种 培养 条件 发酵罐 温度2325；培养基pH 5，整个 发酵 过 程pH 4.5 5；发酵 罐罐 内 压力保 持在0.02 MPa 0.04 MPa；通过 发酵 罐的 进 气阀和 排气 阀将 通风 量调 节 至1 0.5 V/V 1 1.2 V/V(料 液体 积/空 气体 积)。液体菌 种培 养时 间 培养时 间为6 d 8 d。放罐指 标 经镜检 和其 他理 化指 标等 方法检 验质 量合 格，符合 表1规 定即 可放 罐。DB42/T 192.1 2024 7 8 取样检 测 与 质量 要求 取 样 8.1.1 取样方 法 对摇瓶 液体菌 种样 品、培 养器灭 菌后的 空白 培养基 样品、培养过 程中 定期取 样，每 种样品 留样5 瓶（个），每瓶（个）10 mL 20 mL，用 作镜检 和其 它 理化指 标测定。上 述样品4 冰箱 内保存 一周 以上。发酵罐 液体菌 种从 开始生 产24 h 后，每 隔12 h 从取 样 口取样 进行以 下项 目检测。放罐 之前取 样留 样备检。8.1.2 杂菌检 测 真菌检 验。按 照NY/T 1284 的要求 将少 量培 养液 接种 于PDA 培养 基中，置于28 30 恒温 培养48 h，采用显 微镜 和感 官观 察菌 丝生长 状况 和有 无杂 菌污 染；若 出现 香菇 正常 菌丝 白色以 外的 杂色 者，或 有 异味者为 霉菌、酵 母等 杂菌 污染物，必 要时 进行 水封 片镜检。细菌检 验。按 照无 菌操作 将少量 培养 液接 种于 营养 肉汤培 养液 中，置 于2830 恒温 培养24 h 48 h，观察 培养 液是 否浑 浊。培 养液 浑浊，为 有细 菌污染；培 养液 澄清，为 无细菌 污染。8.1.3 菌丝湿 重 采用定 量滤 纸，将 搅 拌均 匀的 液 体菌 液 进 行过 滤，至无水 滴滴 下 后，称 其菌 丝体重 量，然后 减去 滤纸湿重。液体菌 种质 量 质量要 求指 标应 符合 表1 的 规定。表1 质量要 求 项 目 要 求 菌液色泽 菌丝球或菌丝片段呈白色，菌液呈浅棕色 菌液形态 培养液澄清透明，菌丝球、菌丝片段均匀悬浮于液体中，不分层，直径小于 3.5 mm 菌液气味 有香菇菌种特有的气味，无酸、臭等异味 显微镜下 菌丝形态 可见香菇菌种液体培养中特有的菌丝形态，菌丝粗壮，分枝较少，无杂菌 pH（采用酸度计测定）4.5 5.0 菌丝湿重（g/mL）0.15 0.18 留样菌检 划痕处只有香菇菌丝生长 而无霉菌、酵母和细菌等其它杂菌生长 9 使用方 法 DB42/T 192.1 2024 8 将灭菌 冷却 后待 接种 的料 棒放置 在输 送带，输 入至 无菌接 种区。在 接种 区用 接种器 将液 体菌 种注 入料棒，每棒 接种4个6个 接种点，每 个接 种点 接种15 mL20 mL。接 种完 毕后 移至发 菌室 培养。10 标签与 贮存 标签 注明品 种名 称、菌种 级别、生产 日期 和发 酵罐 序号。贮存 10.2.1 摇瓶液 体菌 种保 存方 法 摇瓶液 体菌 种瓶 口用 牛皮 纸包好，放 在4 的 温度 下 可保存1 d 2 d。10.2.2 发酵罐 液体 菌种 保存 方法 液体菌 种即 成即 用，在室 温1518 和 持续 通入 无菌空 气的 条件 下可 保存1 d2 d。11 生产档案 详实记 录母种、摇 瓶液体 菌种和 发酵罐 液体 菌种生 产的每 个环节，记 录内容 按附录B 执行。生产 记录归档 保存 时限 不少 于两 年。DB42/T 192.1 2024 9 A A 附录A（资料 性）香菇液 体菌 种培 养基 配方 A.1 摇瓶菌 种培 养基 配方 表A.1 给出 了摇 瓶菌 种培 养 基配方。生 产用 水应 符合GB 5749要 求，培养 基质 应 符合NY/T 528 要求，玉米粉 使用 前过20目 筛。表A.1 摇瓶菌 种培 养基 配方 蛋白胨 玉米粉 牛肉膏 葡萄糖 酵母膏 KH2PO4 MgSO4 VB1 水 pH 配方 1 5 g 20 g 3 g 3 g 1.5 g 5 mg 1 L 6.06.5 配方 2 20 g 4 g 20 g 5 g 2 g 1 g 5 mg 1 L 6.06.5 A.2 发酵罐 液体 菌种 培养 基配 方 表A.2 给出 了发 酵罐 液体 菌 种培养 基配 方。表A.2 发酵罐 液体 菌种 培养 基配 方 糖蜜 玉米粉 豆粕粉 黄豆粉 酵母浸粉 麸皮 VB1 MgSO4 KH2PO4 消泡剂 配方 1 1%2%2%0.1%0.03%配方 2 1%0.3%0.3%0.1%0.03%0.05%0.03%配方 3 2.5%1%0.4%0.03%以上配 方初 始pH 自然，生 产用水 应符 合GB 5749 要 求，培养 基质 应符 合NY/T 528 要求，玉 米粉 使用前过20 目筛。DB42/T 192.1 2024 10 B B 附录B（资料 性）香菇液 体菌 种生 产记 录事 项 香菇液 体菌 种生 产记 录事 项如下。a)生产投 入品 使用 情况（包 括液体 菌种 的制 作培 养基 质、营 养辅 料、所用 菌种、菌瓶）：1)名称；2)来源；3)用法、用量。b)菌种生 产情 况：1)培养基 制作；2)高压灭 菌；3)接种；4)培养。c)接种栽 培袋 情况：1)数量；2)培养；3)去向。DB42/T 192.1 2024 11 参考文 献 1 GB/T 12728 食用 菌 术语 2 湖 北省 食 用 菌菌 种 管理办 法