肿瘤治疗之双特异性抗体——结构、优势、制备、研究现状.pdf

1 肿瘤治疗之双特异性抗体 2018 年 09 月 09 日 请参阅本文最后一页免责声明 肿瘤治疗之双特异性抗体 结构、优势、制备、研究现状 报告日期： 2018年 09月 09日 1. 双特性抗体简介 双特异性抗体（ BsAb）又称双功能抗体，可同时识别和结合两种不同的抗原和表位，并阻断两种不同的信号通路以发挥其作用。根据不同结构可将双特异性抗体结构主要有 2 大类：含 Fc片段的双特异性抗体（ IgG-like 双特异性抗体）与不含 Fc 片段的双特异性抗体（ non-IgG-like 双特异性抗体）。 IgG-like 双特异性抗体： IgG 样 BsAb 有 Fc 部分，具有 Fc介导的效应功能，如抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ ADCC）、补体依赖的细胞毒作用（ CDC）和抗体依赖的细胞介导的细胞吞噬作用（ ADCP）。分子量相对较大，其 Fc 部分有助于抗体后期的纯化并提高其溶解性、稳定性。 IgG 样 BsAb 相对分子量较大，且 Fc 部分与受体 FcRn 结合，增加了抗体血清半衰期。此类抗体结构主要包括 Triomabs/quadroma、 DVD-Ig（ dual variable domain Ig）、 CrossMAb、 Two-in-one IgG、 scFv2-Fc。 2 肿瘤治疗之双特异性抗体 2018 年 09 月 09 日 请参阅本文最后一页免责声明 non-IgG-like 双特异性抗体： 非 IgG 样 BsAb 缺乏 Fc 片段，仅通过抗原结合力发挥治疗作用，具有较低的免疫原性、易于生产、分子量小等特点。因相对分子量较小，其在肿瘤组织的渗透性较高，因此具有更强的治疗效果。这些 BsAb 有诸多形式，主要包括 TandAb（ tandem diabody）、 scFv-HSA-scFv、 BiTE（ bi-specific T-cell engager）、 DART（ dual affinity retargeting）、Nanobody。 2. 双特异性抗 体的临床优势 BsAb 与普通抗体相比增加了一个特异性抗原结合位点，在治疗方面表现出了以下优势： 介导免疫细胞对肿瘤的杀伤： 双特异性抗体的一个重要作用机制是介导免疫细胞杀伤，双特异性抗体有两条抗原结合臂，其中一条与靶抗原结合，另一条与效应细胞上的标记抗原结合，后者可以激活效应细胞，使其靶向杀伤肿瘤细胞。 3 肿瘤治疗之双特异性抗体 2018 年 09 月 09 日 请参阅本文最后一页免责声明 目前已经批准上市的 2 个双特异性抗体产品都属于这个类别， Trion Pharma 公司开发的 catumaxomab 能够靶向肿瘤表面抗原 EpCAM 和 T 细胞表面受体 CD3，而 Micromet 公司和 Amgen公司开发的 Blinatumomab 可以同时结合 CD19 和 CD3。两者都是通过激活并召集杀伤性 T 细胞，从而达到治疗肿瘤的目的 ; 双靶点信号阻断，发挥独特的或重叠的功能，有效防止耐药： 同时结合双靶点，阻断双信号通路是双特异性抗体的另一个重要作用机制。受体络氨酸激酶（ receptor tyrosine kinase， RTKs）是最大的一类酶联受体，在细胞增殖过程中发挥重要的调节作用，如 Her 家族等。 RTKs 在肿瘤细胞表面异常高表达，导致肿瘤细胞恶性增生，因此也是肿瘤治疗的重要靶点。针对 RTKs 的单靶4 肿瘤治疗之双特异性抗体 2018 年 09 月 09 日 请参阅本文最后一页免责声明 点单克隆抗体已在肿瘤治疗中 得到广泛应用，但是，肿瘤细胞可以通过转换信号通路或通过 HER 家族成员自身或不同成员之间的同源或异源二聚体激活细胞内信号进行免疫逃逸。因此采用双特异性抗体药物同时阻断两个或多个 RTKs 或其配体，可以减少肿瘤细胞逃逸，提高治疗效果 ; 具备更强特异性、靶向性和降低脱靶毒性： 利用双特异性抗体两个抗原结合臂可以结合不同抗原的特点，两个抗原结合臂分别结合癌细胞表面 2 种抗原，可以有效增强抗体对癌细胞的结合特异性和靶向性，降低脱靶等副作用； 有效降低治疗成本： 以 BiTE 为例，与传统抗体相比在组织渗透率、杀伤肿瘤细胞效率、脱 靶率和临床适应症等指标方面都具有较强的竞争力，临床优势显著。特别在使用剂量方面，由于其治疗效果可以达到普通抗体的 100-1000 倍，使用剂量最低可将为原来的 1/2000，显著降低药物治疗成本。相对于组合疗法，双特异性抗体的成本也远远低于两个单药联合治疗。 3. 双特异性抗体的制备方法 双特异性抗体的制备主要有双杂交瘤细胞法，化学偶联，重组基因制备等方法。重组 DNA 技术是目前制备 BsAb 使用最多的技术。 5 肿瘤治疗之双特异性抗体 2018 年 09 月 09 日 请参阅本文最后一页免责声明 化学偶联法： 该方法最早出现于上世纪 80 年代，其原理是通过化学偶联剂（如邻苯二马来酰亚胺、 N-琥珀酰 -3-（ 2-吡啶二硫基）丙酸盐、二硫代酰基苯甲酸等）将两个完整 IgG 或两个F(ab)2 抗体片段偶联成一种 BsAb，这种方法快速简便，但是容易破坏抗原结合部位从而影响抗体活性，同时交联剂本身的安全性和致癌性不确定； 双杂交瘤融合法： 通过细胞融合的方法将 2 株不同的杂交瘤细胞融合成双杂交瘤细胞株，然后通过常规的杂交瘤筛选法克隆靶细胞。由于双杂交瘤的遗传背景来源于亲代的两种杂交瘤细胞，它必然要产生 2 种重链和 2 种轻链分子，而这些轻重链的随机组合配对方式才能产生所需的 BsAb.利用双杂交瘤方法制备双特异性抗体随机性较大，效率低，但是 BsAb 生物活性较好，抗体结构比较稳定。利用 Konck-in-hole 技术可以有效解决异源抗体抗体重链正确配对的难题。制备方法是将一个抗体的重链CH3 区 366 位体积较小的苏氨酸突变为体积较大的络氨酸，形成突出的“杵”型结构；将另一个抗体重链 CH3 区 407 位较大的络氨酸残基突变成较小的苏氨酸，形成凹陷的“臼”型结构；利用“杵臼”结构的空间位阻效应实现两种不同抗体重链间的正确装配。化学偶联法和双杂交瘤融合法生产出的双特异性抗体为鼠源性，具有较强的免疫原性，且产量低纯度差，在临床应用上有很大的制约； 6 肿瘤治疗之双特异性抗体 2018 年 09 月 09 日 请参阅本文最后一页免责声明 基因工程： 利用基 因工程技术制备双特异性抗体是目前最常用的制备方法，其制备原理为利用基因工程技术对传统抗体进行基因工程方面的改造，从而形成多种形式的双特性抗体 。 4. 双特性抗体在肿瘤治疗中的研发现状 自从第一个在欧洲获批上市的双特异性抗体 catumaxomab（ Removab）和第一个在美国获批上市的 blinatumomab（ Blicyto）问世以来，有数十个双特异性抗体正在进行临床开发，有更多的双特异性抗体分子正处在临床前研究阶段，且大部分已经进入临床阶段的双特异性抗体都应用在肿瘤治疗领域。 7 肿瘤治疗之双特异性抗体 2018 年 09 月 09 日 请参阅本文最后一页免责声明 Catumaxomab Catumaxomab（ Removab， Trion）于 2009 年正式获得 EMA批准在欧洲上市，用于治疗恶性腹水（腹腔转移癌晚期患者常见的一种并发症），成为全球第一个上市的双特异性抗体。在 II / III期研究中，腹膜内 catumaxomab 改善了无穿刺存活率和下次腹腔穿刺的中位时间，减少了腹水的体征和症状，并显示出改善 OS的趋势。 最常见的不良反应是发热，恶心，呕吐和腹痛。目前正在进行的临床试验包括卵巢癌、胃癌和上皮癌。 Catumaxomab是一个分子量在 150kDa三功能的抗体，由一个靶向肿瘤 EpCAM的小鼠 IgG2a 和一个靶向 CD3的大鼠 IgG2b 构成，同时还能通过 Fc受体激活单核细胞、巨噬细胞、星状细胞以及 NK 细胞。由于小鼠和大鼠的轻重链之间很少发生错配，通过 quadroma（ hybrid-hybridoma）的方式，将分别表达小鼠和大鼠抗体的杂交瘤进行二次融合，从而得到同事分泌 Triomab 双特异性抗体以及小鼠和大鼠单克隆抗体的杂交瘤细胞株。然后在通过亲和力纯化的方式、分别去除小鼠和大鼠单克隆抗体。虽然 Catumaxomab 是第一个批准上市的双特异性抗体，但同时也具有非常明显的局限性，主要体现在 Triomab 抗体复杂的生产工艺以及异源抗体比较容易产生的免疫原性问题。 8 肿瘤治疗之双特异性抗体 2018 年 09 月 09 日 请参阅本文最后一页免责声明 Blinatumomab（博纳吐单抗） Blinatumomab 于 2014 年 12 月 4 日获得美国 FDA 批准，用于治疗费氏染色体阴性的前体 B 细胞急性淋巴细胞白血病。Blinatumomab 由 Micromet 公司（后被 Amgen 公司收购）开发，是利用 DNA 重组技术制备的一种双特异性的单链抗体 BiTE，通过一条多肽链把靶向肿瘤细胞和 T 细胞表面抗原的两种单克隆抗体的可变区连接起来， Blinatumomab 选择性地靶向 B 细胞表面抗原 CD19，同时特异性地结合 T 细 胞表面抗原 CD3 从而激活 T 细胞。因为主要由两条单链抗体连接而成， BiTE 的分子量较小（ 55-60kDa），容易渗透肿瘤组织。同时 BiTE 缺乏 Fc 段9 肿瘤治疗之双特异性抗体 2018 年 09 月 09 日 请参阅本文最后一页免责声明 因而免疫源性较低。临床试验已经证明 Blinatumomab 即便在很低的使用剂量下，依然可以有效召集 T 细胞并清除肿瘤，显着改善复发或难治性 B 细胞前体 ALL 患者的中位 OS。 其常见的不良反应包括发热，头痛，发热性中性粒细胞减少和外周性水肿。但是由于没有 Fc 片段， BiTE 抗体分子的体内半衰期很短，试剂使用的时候需要额外配备连续输液装置。 2017 年 Blinatumomab全球销售达 1.75 亿美元（ 2014 年 300 万美元、 2015 年 0.77 亿美元、 2016 年 1.15 亿美元）。 其他在研双特异性抗体 目前有多个双特异性抗体正在开展用于治疗肿瘤的临床试验，其结构中多包含 CD3 抗原结合位点（用于募集 T 细胞到肿瘤 细 胞 附 近 ） ， 另 一 个 结 合 位 点 包 括CD19,CD20,CD33,CD123,HER2,CEA，神经节苷脂 GD2， PSMA，gpA33 等等。另外，还有一些双特异性抗体为： HER2 + HER3, 10 肿瘤治疗之双特异性抗体 2018 年 09 月 09 日 请参阅本文最后一页免责声明 IL1 +IL1 ,IL13+IL17, IL17A/IL17F 和 CD30+CD16A。