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2018/1/241树突状细胞的培养2018/1/242 研究背景 研究进展 研究的目的与意义 技术路线 预期结果2018/1/243研究背景 1973年 Stdnman和 Cohn在小鼠脾脏发现具有树枝状突起的独特形态的贴壁细胞，并命名为树突状细胞（ dendritic cell， DC）。 DC是目前所知抗原提呈功能最强的 APC。 最大的特点 是未成熟的 DC具有强大的捕获抗原的能力，成熟的 DC能够刺激初始型 T细胞（ naitve T cell）活化与增殖。而 M 、 B细胞等仅能刺激已活化的的 T细胞或记忆性 T细胞，因此 DC是特异性免疫应答的 始动者 。2018/1/2442018/1/245 DC作为免疫反应中的“ 哨兵 ”，它广泛分布于脑及睾丸以外的全身各脏器，进行“通报敌情”和“发动战争”。2018/1/246研究背景 DC起源于 造血干细胞 （ HSC）。 根据分化来源途径 :髓样树突细胞（ MDC，DC1）和淋巴样树突细胞（ LDC， pDC， DC2）。 MDC与单核细胞、粒细胞有共同的前体细胞。LDC与 T细胞、 NK细胞有共同的前体细胞。 来源于骨髓或胸腺的 MDC和 LDC均为 未成熟 DC,未成熟 DC摄取抗原后发生 迁移 .通过输人淋巴管进入局部 淋巴结 ，并分化为 成熟 DC，提呈抗原激发 T细胞免疫应答口。未成熟 DC低表达MHCll类分子、共刺激分子和粘附分子，高表达 FcR、 CR及 TLR、 MR(甘露搪受体）等。2018/1/2472018/1/248研究背景 未成熟的 DC能通过吞噬和巨胞饮作用摄取杭原，但加工 提呈抗原的能力较弱 ，主要分泌TNF- , IL -1 , IL6等细胞因子。未成熟 DC一但摄取抗原或受到炎性刺激 (如 LPS, TNF- ）即进入成熟阶段。 成熟的 DC表型和功能均发生改变 :高表达 MHCll类分子、共刺激分子和粘附分子 (如 ICAM一 1、DC-SIGN） .不表达 FcR、 CR和病原体受体。虽然摄取和加上抗原的能力降低，却 具有强大的提呈抗原能力 。主要分泌 IL-4、 IL-12等细胞因子。2018/1/2492018/1/24102018/1/2411研究背景 在体内 迁移 是DC的重要特征 。这与其趋化因子受体表达谱有关。 未成熟 DC,表达CCR1、 CCR2、CCR5、 CXCR1和CXCR2。 成熟 DC表达 CCR7和 CXCR4，使其能针对不同趋化因子发生反应。迁移到不同部位产生不同作用。2018/1/2412研究背景DC前体细胞 在骨髓产生，经外周血进入全身各组织，发育为 未成熟的 DC。未成熟的 DC通过吞饮、内吞、吞噬三种方式 摄取抗原， 其表面受体的表达、细胞因子的分泌、形态等发生变化，逐渐 迁移 到淋巴器官并 成熟 。2018/1/2413研究背景未成熟 DC摄取抗原后发生 迁移 .通过输入淋巴管进入 局部淋巴结 ，并分化为 成熟DC，提呈抗原激发 T细胞免疫应答 。2018/1/2414DC的意义DC对外源性和内源性抗原的通过不同途径进行加工，提呈给 CD4+或 CD8+初始 T淋巴细胞，控制着初始 T淋巴细胞的命运 。 DC还可以分泌一些 细胞因子 ，同时促进初始 T淋巴细胞的活化、增殖和发育。CD4+初始 T淋巴细胞通过三种信号（ TCR信号、 共刺激信号 、 细胞因子 ）活化并分化成熟为有功能的效应性辅助性 Th细胞 。2018/1/24152018/1/24162018/1/24172018/1/24182018/1/2419 DC不仅可以激发初始 T淋巴细胞，而且还直接或间接参与 B淋巴细胞、自然杀伤细胞等的免疫应答过程中。 DC是天然免疫与获得性免疫连接的桥梁。2018/1/24202018/1/24212018/1/2422国内外研究进展 国内外研究进展2018/1/24231. R. PAILLOT, Immunology （ 2001）Functional and phenotypic characterization of distinct porcine dendritic cells derivedfrom peripheral blood monocytes从 1014周龄的商品长白猪采集血液，并分离外周血单个核细胞（ PBMC），一部分 PBMC加入重组猪粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子（ 1%rp GM-CSF）和重组猪白细胞介素一 4（ 1%rp IL-4），一部分PBMC又多加了 10ng/ml 肿瘤生长因子 -1 （ TGF-1 ）。在 39 孵育 16h后去除未贴壁细胞，贴壁细胞继续培养，每 3天换一次液并补加细胞因子。 7天后产生 DC。加了 TGF-1 的诱导产生的 Mo LC（朗格汉斯细胞），比 Mo DC更能对同种异体的 T产生有效反应。2018/1/2424 2. I. E. Vincent， （ 2003）Dendritic Cells Harbor Infectious Porcine Circovirus Type 2 in the Absence of Apparent Cell Modulation or Replication of the Virus 实验动物是在 SPF条件下饲养的 PCV2血清反应阴性的瑞士长白猪，通过体外从骨髓和外周血提取 DC前体细胞，诱导分化为骨髓来源的 DC和单个核细胞来源 DC，并与 PCV2相互作用。 研究发现 8090%骨髓来源的 DC和 Mo DC参与到了 PCV2病毒早期感染，并不能把抗原信息传递给 T淋巴细胞， 随着 DC迁移， DC可作为在宿主体内运输病毒的媒介，病毒由此不需要复制就可以扩撒。 外周血加入淋巴细胞分离液 (比重 1.077/L的Ficoll-Paque）进行密度梯度离心（ 1000 g， 25分钟） ,得到的单核细胞用 DMEM培养基培养，并同时加入 10%猪血清、 150ng/ml rp GM-CSF、 100U/ml rp IL-4,培养 67天得到 Mo DC。2018/1/2425 3.Randy E. (2006)Interaction of PRRSV and Porcine Dendritic Cells: Potential Role in Viral 他们研究表明 PDC（猪肺部 DC）比 Mo DC形态和功能更明显， 而且 Mo DC比 PDC更易感 PRRSV，并计划通过用 CFSE（羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂）染料体外标记的方法追踪 PDC的移行，淋巴结或肺部的免疫组化染色则观察不到。 外周血通过密度梯度离心法分离单个核细胞，贴壁细胞 37摄氏度培养过夜之后，加入含有重组猪粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子（ rp GM-CSF）和重组猪白细胞介素一 4（ rp IL-4）培养基并 37摄氏度培养两周，三天换一次培养基并补足细胞因子。两周后收获 Mo DC，并稀释 2 x 105DC中含有 0.51摩尔的 PRRSV 的 NADC-8。两小时后，洗 Mo DC五次加入到组织培养板的空里培养， 40小时后由 PRRSV感染的细胞全部死亡。2018/1/2426 4.Dennis L. （ 2002）Differentiation of porcine dendritic cells by granulocyte-macrophage colony-stimulating factor expressed in Pichia pastoris 因为 GM-CSF和 IL-4可以有效诱导出 Mo DC，由 P.Pastoris（毕赤酵母）分泌的重组 GM-CSF可以作为猪疫苗的佐剂。2018/1/2427 5.CARLOS P.(2001 immune)Porcine dendritic cells generated in vitro: morphological,phenotypic and functional properties 猪的 BM-DC 和 Mo-DC表达骨髓表面标志SWC3， CD1， CD80/86等，并且和人相比， 猪的未成熟和成熟的 DC表面都 持久表达 CD14 和CD16。 外周血单个核细胞（ PBMC）的分离是通过研究所的 36周龄分离 SPF猪外周血在淋巴细胞分离液作用下进行密度离心 (1000 g, 25 min) 得到的，单个核细胞是贴壁细胞经 16h继续培养得到的。2018/1/2428 BMHC（骨髓造血细胞）和 Mo用 DMEM培养基培养，加入 2Mm谷氨酰胺； 100 U/ml 青霉素， 100 mg/ml链霉素， 50 M 巯基乙醇。10%胎牛血清或 10%猪血清（血清的替补品）。对于 BMHC培养， 25 ng/ml (rp) GM-CSF，或单独，或与 rp TNF-a(30 U/ml).联合作用。对 Mo-DC的培养基又加入 150 ng/ml rp GM-CSF, 100 U/ml rp IL-4and PS (Mo-DC medium)。 BMHC用 100-MM在 39摄氏度孵育。培养的方法是借鉴人和鼠科动物 BM-DC的培养。在 BM-DC培养皿中加入 10ml细胞密度为 4 105/ml的 BMHC。第三天全换新培养液。 在第六天和第八天各换一半培养液。 培养六天时间里， BM-DC培养皿中由单核细胞（密度 0.5 106个/ml）产生了 DC。为了让 DC成熟，第二天和第四天在换一半新鲜培养液中，加入 250 U/ml rpTNF-a 或 1 mg/ml脂多糖 (LPS) ，并继续培养 24h（ LPS）或 48h(TNF-a)。 TNF-a能提高 BM-DC产量及刺激 T细胞的能力， BM-DC 和 Mo-DC能介导强烈的 IFN- 和 IL-4反应。2018/1/2429 6.方慧云等。 将外周血中的单个核细胞，经 GM CSF和 IL一 4联合，并分 三组 。在三组收获前一天用加入分别 TNF 、 INF一 、 Ag。结果表明添加TNF 或 INF一 等促细胞成熟剂并 没有达到进一步刺激细胞成熟的效果 ，但可以让细胞维持细胞生物活性的持续力。 DC细胞与 CIK细胞混合培养可以提高 CD8+CD28+细胞群的比例，而且， CIK会因接受了抗原的刺激而增加细胞的扩增能力。2018/1/2430 7.马国强等。（ 2007）用 rhGM CSF， rhIL-4和 rhTNF 联合培养从人外周血诱导培养出了大量的树突状细胞且高表达 HLA DR， CD80， CD83， CD86、 HLA DR+ CD83+及 CD80+CD86+。 8.黄家禹等。（ 2011）研究表明对 于 结核 病 患 者 外 周 血 树 突 状 细胞， LPS比 TNF-a有 着更强的刺激作用 ，能更好地刺激树 突状细胞成 熟。2018/1/2431 9. T.E. Cecerea，（ 2012 ， Veterinary Microbiology） Co-infection of porcine dendritic cells with porcine circovirus type 2a (PCV2a) and genotype II porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) induces CD4+CD25+FoxP3+T cells in vitro 他们主要研究由 PCV2 和 PRRSV分别单独及共同感染的 DC在体外诱导 T Regs的能力 大小。猪繁殖与呼吸综合征病毒可以在体外和体内诱导 T Regs,PCV没有先关报道。由 PRRCV诱导的 T Regs的分化取决于病毒的基因型。 PCV2 和 PRRSV 共同感染在猪群中相当普遍，而且这两种病毒可以减少外周血单个核细胞 (PBMC)对 INF- 的分泌和提高对 IL-10分泌。体外 PCV2感染的 DC仅在胞质中发现 PCV2抗原，而细胞核中没有发现，并且可以显著的增加 CD4+CD25+FoxP3+Tregs(p < 0.05) 。用这两病毒共同感染的这种能力比单独一种病毒感染的要强。2018/1/2432 用经肝素处理的注射器取五头健康猪的外周血，与无菌按 :混合，用淋巴细胞分离液覆盖 (比重 1.077/L的 Ficoll-Paque），并进行 500 g 离心 20 min。 PBMCs 用 DMEM洗三次之后，用完全 DMEM培养基（10% 热灭火的胎牛血清 , 50 2-巯基乙醇 , 100 IU /ml青霉素 , 100 g /ml 链霉素）悬浮， PBMC放在 培养瓶在 37 C 、 % CO2条件下过夜孵育，单核细胞会贴壁生长。非贴壁细胞用 DMEM洗除，并用含有 10% 二甲亚砜 (DMSO)胎牛血清冰冻保存。贴壁细胞用含有 20 ng/ml重组猪粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子（ rp GM-CSF）和 20 ng/ml重组猪白细胞介素一 4（ rp IL-4）的 DMEM培养基在 37 C 、 5% CO2培养五天。在第二天和第五天时换掉一半培养液， 第五天时加入 LPS(2g/ml) ，继续培养至少两天。第七天时用 DMEM洗两次后，收集上清中的非贴壁细胞，即 Mo DC。2018/1/2433 Mo DC用两种病毒的感染复数的 0.1倍剂量感染 ，并在 37 C 用含有 50 mM 2-巯基乙醇 DMEM培养基培养 1小时。 4 C 200 g洗三次，并用培养基重新悬浮。在 96孔组织培养皿中加入 5 104个 /ml DC ，24小时候加入 5 105个 /ml T淋巴细胞 （从 PBMC中已经制备的），共同培养三天。在另外一些试验中，则换成热灭活的两种病毒或 IFN- 。每个实验组的DC和 T淋巴细胞共培养一式三份。细胞因子分析表明， 两种病毒共同感染对 T Regs的作用依赖 T F （生长转化因子 ）而不是 。他们的研究支持猪圆环病毒相关疾病的发病机理，尤其是由T Regs介导的免疫抑制。2018/1/2434 10. Mwangi，（ J.Immunol 2002） DNA-encoded fetal liver tyrosine kinass 3 ligand and gramulocyte macrophage-colone-timulation factor increase DC recruitment to the inoculation site and enheance Ag-specific CD4+ T cell reponses induecd by DNA vaccination of outbled animals 他们通过构建抗 DEC205单链 Ab-Ag-CD40L嵌合体，通过 DC和靶抗原集中在 CD4+T细胞和 CD8+ T细胞周围，直接刺激 CD4+T细胞和CD8+ T细胞，提高 DNA疫苗的效率，将这种载体与质粒 FLT3L/GM-CSF混合免疫牛，可引起特异性 CD4+T细胞反应。2018/1/2435 11.Kugler ， （ Nat Med ， 2002） Regression of metastatic renf cell carcinoma after vaccination whit tumor cell DC hybeids. 通过电穿法将自体肿瘤细胞与自体 DC将融合，可将 DC的免疫刺激功能与肿瘤 A股信息有机的结合起来，从而更有效地诱导机体产生抗肿瘤免疫反应。由此可制成新型瘤苗。 12.朱迅， 2001 将一些细胞因子的基因导入 DC，使之有效表达，在用 Ag触发致敏，可以用于治疗。 将病原体 Ag编码信息基因或 m RNA导入DC后，能在 DC内持续表达病原体抗原。2018/1/2436 脾脏 DC 重组腺病毒载体进行 GM-CSF基因修饰 小鼠黑色素瘤细胞融合 贴壁细胞培养，富集融合细胞。2018/1/2437 13.Dominguez，（ Vet Res,2009） Targting to porcine sialoadhesin recrptor improves antigen presention to T cells. 这位西班牙学者提出了提高 APC的 Ag提呈能力的策略。他们利用猪唾液黏附素（sialoadhesin）的单克隆抗体增强 Ag提呈给 T 细胞的能力。因为猪唾液黏附素可以针对特异性 Ag的 Ab生成。2018/1/2438 14.Exper Rev Vaccines， 2009 Mucasal vaccines: novel advances in technolog and delivery (1)DNA疫苗通过将含 Ag编码基因的质粒 DNA直接导入 DC，经体内转转录、翻译、加工，“天然地表达 Ag蛋白”并通过内质网进入 MHC 类抗原提呈途径诱生 CD8+T细胞应答。 （ 2）由组织细胞摄取、表达、分泌，经由 DC摄取而进入 MHC 类抗原提呈途径诱生CD4+T细胞应答。 由于可以模拟病毒的天然感染过程，因此可有效地诱生特异性抗体和细胞免疫应答，特别是CTL应答。2018/1/2439 15.曹雪涛，免疫学前沿进展， 2009 （ 1） 只有 PP结的 DC能诱导 T 细胞产生高水平的4 7，其它部位的 DC无此作用。即 PP结中的 DC对效应 T细胞归巢到肠道有选择性作用。 （ 2） CCR9被证明是肠道归巢趋化因子受体，还是小肠中 CD4+和 CD8+记忆或效应 T细胞的标志。 CCR9与 小肠上皮和血管上皮的 CCL25结合，促进淋巴细胞进入小肠。并且 CCR9和 4 7具有协同作用。 （ 3）小肠固有层的 DC能够以一种 TGF-和维生素 A代谢产物 维甲酸 (RA)依赖的方式在体外诱导 T reg， RA还可使活化的 Th和 B细胞上调表达肠道归巢受体 4 7整合素和 CCR9，从而是活化的免疫细胞趋引至远端的替他粘膜局部分泌 S-lgA。2018/1/2440研究的目的与意义 目的：建立稳定、高效的猪树突状细胞体外培养的方法。 意义：通过该方法获得足够数量的有功能的DC。为日后进一步研究提供材料。2018/1/2441 DC培养：离心获取猪外周血白膜层细胞，裂解去除红细胞后获得全部白细胞，贴壁培养获得单核细胞，加入重组猪粒细胞 -巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF)+重组猪白细胞介素4(lL-4)，体外培养 7、 9、 12 d获得 DC，以流式细胞术分析表型，体外混合淋巴细胞反应检测细胞抗原提呈功能，电镜观察细胞形态。技术路线2018/1/2442外周血种板PBMC的制备5 106/ml 6 106/ml 7 106/mlMo DC的诱导第 7天 第 9天 第 12天细胞表面标记物检测细胞表面标记物检测、光镜与电镜观察、 体外混合淋巴细胞反应细 胞 因 子密度梯度离心流式细胞仪rp GM-CSF、 rp IL-42018/1/24431.PBMC的制备 从猪采集血液 进行密度梯度离心 裂解液去除红细胞 获得全部 PBMC。2018/1/24442.Mo DC的诱导 PBMC接板 加入重组猪粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子（ GM-CSF）和重组猪白细胞介素 -4（ IL-4） DMEM， 16h后贴壁细胞，每 3天换一次液 培养第 6天加 TNF a 第 7、 9、 12天收集 DC2018/1/24453.观察 DC形态 相差显微镜观察 扫描电镜观察。2018/1/24464.体外混合淋巴细胞反应 同种异体淋巴细胞，作为应答细胞； 培养的 DC，作为刺激细胞； 在 96孔培养板中，按刺激细胞与应答细胞比为 1： 10、 1： 100、1： 1 000接种，每个样品设 3个重复孔，并设阴性对照孔 (只加应答细胞 )和对照孔 (只加刺激细胞 )， 37 下 5 CO2培养 4 d后弃上清，每孔加 MTT20ul/孔，孵育 4h。吸去上清，加入 DMSO100 微升，室温微型振荡 10min，测 OD492值，结果以 3孔均值表示，计算 SI。 实验数据经 SPSS 11 0统计学处理，以 x S表示，采用单元素方差分析法。 SI=(试验孔 OD-对照 OD)阴性对照孔 OD2018/1/24475.流式细胞术分析表型 CDla、 CD14、 CD16、 CD80、 CD83、 CD86和 HLA一 DR 取 rGM一 CSF、 rIL一 4和 TNF一 a刺激前的贴壁细胞，做为对照组。 将 GM一 cSF、 IL一 4和 TNF一 a刺激后的悬浮细胞，作为实验组。 二组标本一起上流式细胞仪，进行表型测定。2018/1/2448预期结果 成功建立成熟的 DC 体外培养技术 ,并通过有功能的 DC提高机体的免疫能力。
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