2020-2021浅析药物临床前研究过程分析报告.pptx

,2020-2021浅析药物临床前研究过程分析报告,引言,近几十年来，随着药物作用靶点不断涌现、药物筛选和优化技术不断创新，全球小分子和大分子 药物市场均保持着稳定较快的成长。同时，新药研发成本持续提升逐步成为行业常态，新药研发 难度持续加大、新药研发成功率不断降低。因此，临床前研究作为新药发现的核心环节，重要性 日益加深。而国内市场方面，在近年政策驱动下，药品行业正处于深刻变革进程中，“鼓励创新、 接轨国际”将是未来的大趋势。在这种环境下，me-too类的创新药将逐步丧失生存的土壤，向 Me-better/Best-in-class过渡，最终开发First-in-class的药物，将是我国创新药市场的必经之路。基 于此，新药临床前开发将至关重要。本篇报告着眼于新药临床前研究的细节过程，通过对化学药和生物药类别特性和相关法规的介绍； 通过对药物发现、药物临床前生产、药物临床前评价三个方面的细节分析，初探化学药和生物药 临床前研究各步骤的研究内容、目标和具体方法。,目录,药物类别特性和相关法规,01,药物发现,02,药物临床前生产,03,药物临床前评价,04,01,药物类别特性和相关法规,1.1化学药的定义和特性,化学药是指通过合成或者半合成的方法制得的原料药及其制剂；天然物质中提取或者通过发酵提取的新的有效单体及其制剂；用拆分或者合成等方法制得的已知药物中的光学异构体及其制剂。化学药多为小分子药物，结构比较容易鉴定，同时以口服为主，可直接进入细胞产生药效。随着 生物药越来越多应用于临床治疗，化学药在医药市场的占比正逐步降低，但仍是当前候选药物的 最主要来源。化学制药产业价值链包括基础化工原料、医药中间体、化学原料药和化学制剂。图1、化学制药产业价值链,国家食品药品监督管理总局规定化学药品新注册分类共分为5个类别：,1.1化学药的类别,1类,境内外均未上市 的创新药含有新的结构明 确的、具有药理 作用的化合物， 且具有临床价值 的药品。,2类,境内外均未上市 的改良型新药在已知活性成份 的基础上，对其 结构、剂型、处 方工艺、给药途 径、适应症等进 行优化，且具有 明显临床优势的 药品。,3类,境内申请人仿制 境外上市但境内 未上市原研药品 的药品该类药品应与原 研药品的质量和 疗效一致原研药品指境内 外首个获准上市， 且具有完整和充 分的安全性、有 效性数据作为上 市依据的药品。,4类,境内申请人仿制 已在境内上市原 研药品的药品该类药品应与原 研药品的质量和 疗效一致。,5类,境外上市的药品 申请在境内上市,1.2生物药的定义和特性,生物药是指运用生物学、医学、生物化学等的研究成果，利用生物体、生物组织、细胞、体液等制造的一类用于预防、治疗和诊断的药物。生物药尤其是抗体药优点在于靶向性高、选择性好，因此疗效确切、副作用小；缺点有膜透过 性差（不易进入细胞，很难突破血脑屏障）、部分具有免疫原性等。表1、生物药特性,生物药包括氨基酸及其衍生物类、多肽和蛋白质类、 核酸及其衍生物类、糖类、脂类、激素类、生物制品 类（疫苗、细胞因子、生长因子、抗毒素及抗血清、 血液制品、抗体、酶和辅酶等）WHO INN已发展和建立了近40种生物药的INN药学分类， 包括单抗、抗体受体融合蛋白、各种多肽药物、重组 蛋白酶等。,表2、生物技术药物部分种类统计,1.2生物药的类别,1.2生物药的类别,表4、预防用生物制品注册分类列表,表3、治疗用生物制品注册分类列表,2017年10月，国家食品药品监督管理 总局起草药品注册管理办法(修订 稿)，按照产品成熟度不同分别将预 防用生物制品和治疗用生物制品分别 分为5个大类，新的注册分类更加侧重 于是否原创，未对生物制品属性、制 备和处方工艺、剂型、给药途径等进 行分类，更方便注册申报。,1.3化学药和生物药区别,相关法规,药品注册管理办法（局令第28号）对于临床前的规定：第二十一条 为申请药品注册而进行的药物临床前研究，包括药物的合成工艺、提取方法、理化性质及 纯度、剂型选择、处方筛选、制备工艺、检验方法、质量指标、稳定性、药理、毒理、动物药代动力学 研究等。生物制品还包括菌毒种、细胞株、生物组织等起始原材料的来源、质量标准、保存条件、生物 学特征、遗传稳定性及免疫学的研究等。第二十二条药物临床前研究应当执行有关管理规定，其中安全性评价研究必须执行药物非临床研究质量管理规范(GLP)。图2、新药研发历程,1.4,相关法规,1.4,药品不同阶段的相关规范：,药物非临床研究质量管理规范 (GLP)：非临床安全性评价试验设计、实施、查验、记录、归档保存和报 告等组织管理过程的质量体系。开展非临床药物安全性评价的机构需要有GLP认证资质。GLP认证分为申请 与受理、资料审查与现场检查以及审核与公告三大环节。要点：申请试验项目应满足认证管理办法要求组织管理体系设置应合理实验设施及仪器设备能满足开展试验的需要实验动物饲养管理应规范,记录应完整参加研究的人员必须训练有素从始至终必须有严格的管理和监督实验的各个环节都必须制订出SOP（标准操作程序）且具有可操作性供试品的管理记录应完善,相关法规,1.4,相关法规,1.4,由于各国对药品注册管理上的差别,所制定的GLP规范也有所不同。非临床药物安全性评价GLP认证资质颁发机 构主要包括我国国家食品药品监督管理总局(NMPA)、美国食品药品监督管理局(FDA)、经济合作与发展组织(OECD)。药品出口必须凭相关国际机构GLP认证实验室出具的安全性评价数据到相关部门登记注册。表5、NMPA、FDA、OECD GLP规则异同比较,02,药物发现药物靶点发现及选择先导化合物发现 先导化合物优化,药物临床前研究过程,2,药物临床前研究,药物发现,药物靶点发现及选择,先导化合物发现,先导化合物优化,药物临床前生产,三阶段：实验研究、 小量试制、中间试制,化学药生产,生物药生产,药物临床前评价,药代动力学研究,药效学研究,安全性评价,2,新药研发过程与CXO关系,药物靶点的发现及选择,2.1,寻找疾病相关的生物分子线索,对相关的生物分子进行功 能研究，以确定候选药物 作用靶标,针对候选药物作用靶点， 在分子、细胞和整体动物 水平进行药理学研究，验 证靶标的有效性。,选定一种潜在的可治疗性疾病作为研究目标之后，就需要识别与疾病相关的靶分子，即确定有特殊生物活 性且有潜在治疗作用的分子（通常是蛋白质）。鉴定出在普通及特殊细胞中起关键作用的多种蛋白，形成如何调节特定的疾病相关蛋白的功能的假说。这 些假说的基础可以是一个科学理论，也可能是由特殊疾病组织的基因分析所获得的信息。建立假说的过程 称为靶点确认。根据人类基因组学计划研究成果估计，人体内可能的药物作用靶点大约有5000个以上，更多的药物作用靶点有待于进一步挖掘。图3、药物靶点发现与确证流程,药物靶点的发现,2.1,靶基因和靶蛋白与疾病间的关系尚不清楚，但是作为潜在的药物靶点并不影响其对小分子配体的亲和选择作用， 在疾病细胞或动物模型的活性检测及临床研究中可以进一步了解靶点与疾病间的关系，实现对靶基因或蛋白的 功能分析，从分子水平上揭示疾病机理及其治疗机制。表6、药物靶点的发现技术,药物靶点的发现,2.1,结构特异性药物与受体结合，大多数临床应用的药物属于此类，产生生物活性的类型 和强度主要是因为药物分子与特异的生物大分子在空间发生互补的相 互作用或复合而发挥药理作用，主要包括受体、酶、离子通道、转运 体、核酸等。这些大分子是现代新药研究与开发的关键，需要寻找、 确定和制备药物筛选靶点。,图4、两种药物的作用方式结构非特异性药物不与受体结合，作用主要取决于分子的物理或物理化学性质，如甘露 醇改变渗透压产生利尿作用。,药物靶点的发现：蛋白质组学方法,2.1,蛋白质组学主要是寻找小分子作用的蛋白质，分离纯化，确定小分子的靶标，为其作用方式提供直接证据。蛋白质差异表达的应用 化学小分子作用前后细胞蛋白质的种类和数量发生了变化，通过对差异表达的检测可以估计小分子的作用方式，筛选出相应靶标。,荧光差异二维凝胶电泳技术,相对于普通凝胶电泳，可在一块聚丙烯凝 胶上直接比较两种蛋白质样本，避免了两 块凝胶比较时可能产生的系统误差。可以定量分析大量修饰过的蛋白，提供结 构和翻译后修饰信息，使重要生物系统变 化的鉴定和蛋白功能阐述得以实现可以定量分析截短的或部分降解的蛋白质。,色谱共洗脱,配体-靶标复合物在高效液相色谱共洗脱加 上配体-靶蛋白结合导致化合物色谱滞留时 间的特征性转移可用高效色谱液相法-质谱/质谱法来确定 靶蛋白。,2.1,蛋白质亲和特性的应用 亲和纯化是利用生物分子间的特异性结合进行蛋白质的分离和纯化。利用蛋白质 亲和特性研究药物与靶蛋白的结合，需要对药物分子进行构效关系研究，但无需了解药物与靶蛋白之间 可能发生的某些特定的细胞或生化反应。研究可能受药物小分子衍生产物的限制,合适的作为阴性对照的 化学小分子药物也较难得到。,药物靶点的发现：蛋白质组学方法,细胞培养稳定同位素标记法,在细胞培养过程中利用稳定同位 素标记的氨基酸结合质谱技术对 蛋白的表达进行定量分析的一种 体内代谢标记技术。目前标记的氨基酸的种类已扩展 到亮氨酸、精氨酸、赖氨酸、甲 硫氨酸以及酪氨酸等。,小分子探针,小分子探针主要由报告基团、连 接基团以及活性基团组成作用原理是小分子活性基团部分 与靶标紧密结合，而报告基团部 分可有效标记靶标生物大分子， 之后通过亲和层析、凝胶电泳和 质谱分析等手段确认靶标蛋白。,蛋白质芯片技术,将一个蛋白质库以二维可设定位 置的网格格式固定在一个载玻片 或芯片上，可测定亲和力低和含 量低的蛋白质。由于蛋白会变性，制造过程中要 保证蛋白的构象和功能，并且要 表达和纯化大量正确折叠且有活 性的蛋白，蛋白质芯片耗时长， 实验要求高，制造难度远高于基 因芯片。,2.1,蛋白质稳定性的应用 基于靶蛋白与小分子结合后稳定性变化，包括抗酶解活性、热稳定性等，发展出了一 系列小分子靶标的筛选鉴定方法。,药物靶点的发现：蛋白质组学方法,蛋白质抗酶解活性,小分子化合物的结合可能会掩盖 蛋白酶的剪切位点或结合小分子 后的靶蛋白局部或整体构象的稳 定性增加，对蛋白酶的易感性下 降，导致结合小分子的靶蛋白可 能较未结合状态的靶蛋白不易被 蛋白酶降解。,氧化速率的蛋白稳定性(SPROX),SPROX与药物亲和反应的靶点稳 定性（DARTS）类似，DARTS利用 的是蛋白质不同的水解特性，而 SPROX利用的是不同的折叠状态 和热力学稳定性。小分子化合物与靶蛋白结合后可 能对靶蛋白的折叠状态以及热动 力学稳定性产生影响而使靶蛋白 发生变化。,蛋白质热稳定性,临床药物作用于细胞裂解液中不 同的靶蛋白时，所有的靶蛋白都 有其独特的熔解曲线，当已知可 结合到这些蛋白上的药物加入细 胞裂解液中，可观测到明显的熔 解曲线移动，根据这一原理开发 出细胞热转移(CETSA)方法可以直接测量药物到达靶细胞的 程度，检测小分子在细胞裂解液 甚至完整细胞组织中的作用。,2.1,药物靶点的发现：基因组学方法,基因组学方法主要分析化学小分子对基因组表达水平的影响，获得小分子作用的特征表达谱，通过分析 确定分子靶标。但由于基因表达与蛋白质表达之间的对应关系存在一定的不确定性，不能直接确定药物 靶标，因此存在一定的局限性。基因芯片技术在DNA测序、基因表达分子与基因调控机制研究、基因药物设计,与筛选等方面应用广泛，利用基因芯片技术和双重荧光法，通过分析检测正常 组织和癌细胞中MicroRNAs（miRNAs）的差异表达，获得miRNAs癌症表达谱， 并进一步确定程序性细胞死亡因子。,基因芯片技术,基因表达谱存在较多无效信息和干扰信息，通过一定的选取可发掘在相应组织,(如肿瘤组织) 中特异表达的基因和药物治疗的靶序列。特征基因集合建立后， 联合人工构建菌株技术，用这些基因构建相关预测菌株，这些预测菌株的基因 表达可直接揭示相关药物的作用机制。,特征基因及人工构建菌株,在基因组中，由一个基因突变引起的表型改变可被其他基因的过表达消除，该,现象是生化抑制策略的基础。生化抑制策略是用化学抑制剂作为“突变基因”， 而其他部分纯化的蛋白混合物作为一种“过表达蛋白”，以此研究相关化学抑 制剂的作用方式与靶标。,生化抑制策略,药物发现中的靶点选择过程是由科学、医学、市场、法规及战略性思考间的复杂平衡。药物失败的一个 主要原因就是开发初期对药物靶点生物学功能的认识不足或错误理解。因此，确定靶点，识别并确认其 生理学、病理学特征是药物开发阶段极其重要的一个部分。,药物靶点的选择,2.1,靶点选择 考虑因素,靶标的有效性， 靶标与疾病相关 且通过调节靶标 的生理活性能有 效地改善疾病症 状,靶标的副作用，无 论与疾病多相关， 如果对靶标的生理 活性的调节不可避 免地产生严重毒副 作用，将其选作靶 标也不合适,旧靶点与新靶点、 已有药物与尚无药 物、靶点作用单一 与靶点作用复杂、 靶点作用在上游与 靶点作用在下游等 多因素的影响及优 劣,化学药先导化合物的发现,2.2,苗头化合物是指一个对特定靶点有活性的化合物，可能是天然配体或从文献中选取的分子。把筛选中发现 的“苗头化合物(hits)”变成“先导化合物”（Hit to Lead），先导化合物可能是筛选出的一个苗头化合 物或者一系列的同系物，也可能是来源于文献的化合物。对于高通量筛选，可能会产生离散的、多个系列 的苗头化合物，这就需要选择其中一个系列继续研究。图5、先导化合物的发现流程,化学药先导化合物的发现,2.2,化学药先导化合物的发现,2.2,1、广泛筛选：获得先导化合物的传统方法，是在众多研究的基础上获得生物活性物质的过程。 初期的新药寻找和先导化合物的获得都是以这种方法进行的。早期的筛选是从天然药用植物中提 炼有效成分为特点。随着化学方法的日益进步和医疗需求的不断提高，促使人们进行大规模广泛 的药理筛选，发现了大批有医疗价值的化学药品。2、意外发现：获得先导化合物和药物的方法之一，如抗菌药青霉素、抗肿瘤药顺铂和viagrat21等，人们随后对其进行构效研究，开发出一系列的新药。,化学药先导化合物的发现,2.2,由药物副作用发现新的先导化合物,常可从已知药物的毒副作用出 发找到新药或将毒副作用与治 疗作用分开而获得新药。在某些情况下，某药物的毒副 作用能对另一疾病有治疗作用， 例如吩噻嗪类抗精神失常药氯 丙嗪及其类似物是由结构类似 的抗组胺药异丙嗪的镇静副作 用发展而来的。,通过化合物代谢研究得到新的先导化合物,药物通过体内代谢过程可能被 活化，也可能被失活。甚至转 化成有毒的化合物。可以选择其活化形式或考虑口 服以避免代谢失活或毒化的结 构作为药物的先导物。运用这类先导化合物，得到优 秀的药物的可能性较大，甚至 直接得到比原来更好的药物。 如奥沙西泮就是地西泮的活性 代谢物。,以现有突破性药物作为新的先导化合物,近年来随着对生理生化机制的 了解，得到疾病治疗的突破性 药物称为原形药物。以原形药物为先导化合物，通 过生物电子等排等方法获得了 大量的“Me-too”药物。,通过代谢产物寻找新的先导化合物,对动物的排泄物和分泌物等的 研究，如抗瘤酮A10是一个从 人的血液和尿液中分离出来的 天然小分子抗癌活性物质。作 为寻找无毒抗癌药物的新的先 导化合物，抗瘤酮A10是一个 理想的分子，其抗瘤结构类似 物的设计、合成和构效关系的 研究，国内外已有大量报道。,3、根据疾病的发病原因和药物作用机理针对其关键环节及限制性步骤，同时考虑药物在体内的转运和代谢设计化学药物，称为摹于机理的药物设计。它是先导化合物发现的有效捷径。人的机体是由细胞组成，细胞的活性受外部信号控制。外部信号传导到细胞内部，引起细胞内的一系列反应：信号传导途径一旦发生差异，就会导致平衡失调。这是疾病机 理的基础，在此基础上对信号分子的作用机理进行研究。从而发现和获得新的先导化合物。,化学药先导化合物的发现,2.2,4、通过化合物库获得世界上大型药物研究和开发组织都有自己分离、合成或收集的化合物储备，形成化合物库：包括天然产物 提取分离、结构测定所得的天然产物库，化学合成特别是用组合化学技术形成的化学分子库，通过蛋白质 表达建立的基因工程库等。,天然产物是先导化合物发现的有效途径,、,主要有动植物和微生物发酵产物两方 面。天然产物又称次级代谢产物，其蕴藏 资源非常丰富，特别是海洋生物资源。 天然产物在抗肿瘤、抗病毒、抗菌、 治疗心脑血管疾病以及抗衰老等领域 具有优势。从特殊生态环境下生长的植物(如高原 高寒、高盐高压等地区的生物)以及 有毒植物、低等植物和真菌等中发现 结构新颖的活性天然产物的机率也比 较高。,组合化学和化合物组合库是一种合成策略,将一些基本的小分子(称为构造砌块， 如氨基酸、核苷酸、单糖以及各种各 样的化学小分子)通过化学或生物合成 的程序系统地装配成不同的组合，目 的是得到大量的、具有多样性特征的 化合物，建立大容量的化合物库。化合物库结合群集筛选方法用于新药 研究和开发中的先导化合物的发现， 基本原理足在芯片或合成珠等同体相 载体材料表面，通过连接功能进行原 位合成、原位筛选。,基因重组技术,合成结构复杂的天然化合物及利用微 生物产生新结构类型活性物组成基因 重组库。将一些靶酶的活性中心、受体或受体 的亚基等在微生物中大量表达，满足 了大规模筛选样品的需要，并且可以 用来确定一些尚不清楚的药物作用靶 位。,化学药先导化合物的发现,2.2,5、高通量虚拟筛选利用计算机强大的计算能力。采用三维药效基团模型或分子对接的方法，在化合物数据库中寻找可能的活 性化合物的方法。在找到一些潜在的活性分子之后，可以通过向有关公司订购、合成或提取分离的方法得 到样品，并进行药理测试。,基于药效基团的数据库搜索模型,一种重要的间接药物设计方法。药效基团通常是指 那些可以与受体结合位点形成氢键相互作用、静电 相互作用、范德华相互作用和疏水键相互作用的原 子或官能团。药效基团及药效基团元素在空间的分布（距离限制） 构成三维药效基团。三维药效基团模型一般是通过 对一组有生物活性的化合物进行结构活性关系分析， 找出其共同的特征结构来建立的。还可以通过活性 化合物与其靶标的复合物结构进行分析得到三维药 效基团模型。,基于分子对接的虚拟筛选分子对接技术,指分子模拟环境中，两个或两个以上的分子模型通 过几何形状、化学环境及能的匹配形成最佳结合的 技术。分子对接的虚拟筛选需要靶标生物大分子和 小分子化合物的三维结构信息。首先要建立大量化合物(例如几十个甚至上百个化合 物)的三维结构数据库。然后将库中的分子逐一与靶 标分子进行“对接”，通过不断优化小分子化合物 的位置(取向)以及分子内部柔性键的面角(构象)， 寻找小分子化合物与靶标大分子作用的最佳构象， 计算其相互作用及结合能。,化学药先导化合物的优化,2.3,先导化合物的优化是选择一个先导化合物对其进行临床前评估，将其转化为候选药物的过程：修饰先导化合物时，关注其物理化学性质的变化对于没有选择性的化合物，考虑脱靶效应/毒性密切关注临床前研究要求,图6、先导化合物的临床前评估因素,图7、先导化合物的优化方法,2.3化学药先导化合物的优化：生物电子等排,生物电子等排体是具有相似的分子形状和体积、相似的电荷分布，并由此表现出相似的物理性质(如疏水 性)，对同一靶标产生相似或拮抗的生物活性的分子或基团。药物设计中常用的生物电子等排体如表所示。 采用生物电子等排体替换法优化得到的新化合物往往会与先导化合物具有类似的或具有相反的生物活性。表7、药物设计中常用的生物电子等排体,化学药先导化合物的优化：前药修饰,2.3,前药是指一些在体外活性较小或者无活性的化合物，在体内经过酶的催化或者非酶作用，释放出活性物 质从而发挥其药理作用的化合物，其常常指将活性药物(原药)与某种无毒性化合物以共价键相连接而生 成的新化学实体，即前体药物。前药应具备以下三个条件：一是根据具有生物活性的药物分子性质，按治疗需要进行化学改造；二是进入机体后，不论是否需要酶的作用，要保证恢复原来的药物分子；三是本身不显示生物活性。前药修饰目的：,提高药物选择性,增强药物稳定性,延长药物作用时 间,改善药物吸收， 提高生物利用度,改善药物溶解性,降低毒副作用,2.3化学药先导化合物的优化：软药、硬药、孪药,软药：本身有生物活性的药物，在体内起作用后，经预料的和可控制的代谢作用，转变为无活性和无毒性化合 物。因为药物一旦到达作用位点，呈现了预期的药效反应后，就应经代谢途径以适宜的速度排出体外，否则会 继续保留在体内，产生的药效长于预期时间，会造成药物在体内蓄积，导致细胞毒性。目的：在原药药物分子中设计极易代谢失活的部位来设计安全而温和的药物。软药缩短了药物在体内的过程，避免了有毒的代谢中间体的形成，使毒性和活性得以分开，减轻药物的毒副作用，提高了治疗指数。条件：分子结构中含有易代谢的部位；代谢过程清晰，即代谢方式和代谢的速率须按预期进行。硬药：与软药相反，是具有发挥药物作用所必需的结构特征，在体内不能被代谢，直接从胆汁或肾排泄的药物 或者不易代谢、需经过多步氧化后排出体外的药物。硬药可以解决药物代谢产生毒性产物的问题，因此使用安 全。但在实际的药物开发中，由于体内酶的作用很强，使得开发成功的硬药数量非常有限。只有亲水或疏水性 极强的化合物，或者由于功能基的位阻较大，不易代谢的化合物，才符合硬药的定义。、孪药：将两个相同或不同的先导化合物或药物经共价键连接，缀合成一个新的分子，经体内代谢后，生成以上 两种药物而产生协同作用，增强活性或产生新的药理活性、或者提高作用的选择性。,2.3化学药先导化合物的优化：计算机辅助,运用计算机辅助药物设计技术进行先导化合物优化，较之前药理学家借助各类模型或者药物化学家对大量 化合物展开合成等方式展开规模较大的筛选，可以全面提升整体工作效率。计算机辅助药物设计在先导化 合物优化上的应用,主要包括基于结构的药物设计、基于配体的药物设计、高通量虚拟筛选等技术在先导化 合物优化上的应用。,基于结构的药物设计,根据药物靶点结构，研究受 体和小分子之间的相互作用， 设计与活性口袋互补的新分 子或寻找新型先导化合物的 技术。,基于配体的药物设计,从已有的活性小分子结构出 发，通过建立药效团模型或 定量构效关系，预测新化合 物活性或指导原有化合物结 构改良。,高通量虚拟筛选,针对靶点的三维结构或已建 立的药效团模型、QSAR模型， 从化合物数据库中，将符合 条件的小分子挑选出来，进 行生物活性测试。,2.3化学药先导化合物的优化：定量构效关系,定量构效关系（简称QSAR），QSAR研究基于生物活性变化与一组化合物中的结构和分子变化相关联，从相关性产生统计模型，以开发数学模型预测新型化合物的生物学特性。,图8、QSAR模型基础结构,目的将结构特征改变与其各自生物活性变化相关联的尝试；设计新的候选药物；有助于预测化合物的毒性；有时有助于阐明酶的化学-生物相互作用的机制；预测设计、不可用化合物和未测试活 性化合物的生物活性。,2.4生物药先导化合物的发现,表8、先导化合物类型及优缺点,靶点的生物学功能 明确后，必须找到 与靶点准确结合的 药物并与该靶分子 进行生物学效应实 验。,先导化合物将被发 现和筛选出来并优 化成符合药物特性 的形式,在分子、细胞和整 体动物水平进行药 理学研究，在人类 疾病的动物模型中 观察疗效并进行安 全评价，验证靶标 的有效性。,图9、生物药的研发流程,作为药物初步结构类型和线索物质,发现先导 化合物并进行结构变换和修饰,可得到具有优 良药理作用的药物。选择何种类型先导化合 物对药物开发成功率有较大影响。,2.4生物药先导化合物的发现,2.4生物药先导化合物的发现,杂交瘤平台,杂交瘤技术是传统的制备手段，其获得的抗体结构稳定，亲和力 较好，但也存在周期长和遗传异质性的缺点。有两次筛选过程， 第一次是使用选择性培养基选出杂交瘤细胞，第二次是进一步选 出能产生需要的抗原特异性抗体的杂交瘤细胞。通过对已有的杂 交瘤细胞测序，获得抗体的基因序列，即可利用体外重组技术表 达抗体。表9、杂交瘤与其他技术优缺点比较,图10、杂交瘤平台,2.4生物药先导化合物的发现,噬菌体天然抗体文库目前体外筛选人类重组抗体最常用的技术，将单链抗体（scFv）或抗原结合片段（Fab）展示于噬菌体表面， 并构建数百万甚至数十亿个展示出抗体片段的噬菌体，得到一个数以千计的噬菌体文库，每个噬菌体携带不 同的抗体，经过数轮的“吸附-洗脱-扩增”，最终分离出具有最高亲和力和稳定性的展示抗体的噬菌体。评价：技术成熟稳定，可获得更大的库容量，强大和完善的大肠杆菌表达系统和文库的可测量性，可设计多样化的筛选策略获得识别突变抗原的特异性的抗体，通过选择和对筛选条件的控制可针对特定的抗原构象或表位产生抗体，如加入竞争物可以筛选靶向指定表位的抗体。,表10、噬菌体天然抗体文库与杂交瘤平台特点比较,图11、噬菌体天然抗体文库筛选过程,2.4生物药先导化合物的发现,转基因小鼠抗体生成从鼠抗体生成基因被相应人基因所取代的小鼠开始。要求人的抗体基因片段在小鼠体内进行有效的重排与表达且能与小鼠细胞的免疫系统信号机制相互作用，使小鼠在受抗原刺激后，人抗基因片段能被选择，表达并活化B细胞分泌 人抗体。采用在鼠胚胎干细胞（ES）中的同源重组来使得鼠原有基因缺失，再通 过显微注射等技术将重建的人源抗体胚系基因微位点转入小鼠体内，最终由单克 隆抗体的杂交瘤分泌出全人序列的抗体。,由于抗体是在体内产生，经历正常装配和成熟过程，保证成品具有较高的靶结合 亲和力,且时间较短、费用较低。但存在免疫耐受，虽然可以通过免疫佐剂的使 用和免疫方法的改进来提高免疫反应强度，但对于一些人类抗原仍然较难获得高 亲和力抗体，且存在鼠源抗体干扰和对毒性抗原较难进行免疫的问题。,图12、 转基因小鼠流程,2.4生物药先导化合物的发现,酵母展示平台,建立全人非免疫单链抗体酵母展示文库，可以快速针对不同靶标筛选高 亲和力全人抗体序列。利用从未免疫的健康人群的外周淋巴细胞中获取 的Naive可变区cDNA片段，通过基因工程技术构建于酵母表面展示重组 载体上，构建完成非免疫scFv酵母展示文库。配合高通量筛选的流式细 胞术，在8-10周内得到初筛序列，4-6周内得到亲和力成熟至pM级别的 候选全人抗体序列。,其优点在于：1）真核表达使得其展示的抗体折叠更完全；2）可有效与 流式细胞术结合，提高筛选通量，并可将定量鉴定引入了筛选过程。,图13、酵母展示平台,2.4生物药先导化合物的发现,B细胞克隆免疫动物细胞分离获得浆细胞，使用流式细胞术将它们彼此分离。筛选分离的细胞以找到产生所需抗体 的克隆，并扩增克隆的基因克隆到表达载体中，通过酶联免疫吸附测定（ELISA）筛选表达较好的克隆。 然后进行测序，利用体外重组技术生产抗体。图14、基于单个B细胞的单克隆抗体筛选平台,2.5生物药先导化合物的优化,嵌合或人源化降低免疫原性：基于抗体结构模型的基础上，兼顾活性、免疫原性和产量，可以进 行抗体人源化设计。通过嵌合或人源化，使抗体更接近人类抗体。 人-鼠嵌合抗体是将鼠抗体可变区基因片段连接到人抗体恒定区基 因上。人源化抗体是将鼠抗体的互补决定区（CDR）移植到人抗体 的相应部位，这样人源化程度可达90%以上。,嵌合抗体:利用DNA重组技术将异源单抗的轻、重链可变区基因 插入含有人抗体恒定区的表达载体中，转化哺乳动物细胞表达 出嵌合抗体，表达的抗体分子中轻重链的V区是异源，C区是人 源，减少了异源性抗体的免疫原性，同时保留了亲本抗体特异 性结合抗原的能力。全人源化抗体:将人类抗体基因通过转基因或转染色体技术，将 人类编码抗体的基因全部转移至基因工程改造的抗体基因缺失 动物中，使动物表达人类抗体，达到抗体全人源化的目的。,图15、鼠抗、嵌合抗体、 人源化抗体、全人源抗体,2.5生物药先导化合物的优化,对天然蛋白结构进行改造或修饰：各种修饰多从改变重组蛋白质的性状入手，如增加分子量、减缓蛋白酶降解、降低免疫原性、提高生物及化学 稳定性等，进而改善其体内药代动力学性质，弥补某些体内功能蛋白的缺陷或增加蛋白在人体内的功能，延长 体内半衰期或加速体内的释放，降低中和抗体产生率，提高患者适应性及治疗效果等。性质优化：抗体基因胚系化，以减少免疫原性表达水平，可溶性，生产可行性免疫球蛋白IgG类型转换，抗体片段化，蛋白融合，骨架化抗体特异性优化：为提高抗体的靶向性，需要对抗体进行工程改造以优化其特异性。随机诱变和靶向诱变是常用优化抗体特异性 的方法。,2.5生物药先导化合物的优化,体外亲和力成熟：对于治疗性抗体来说，抗体亲和力的提高有助于降低用量和毒副作用。抗体体外亲和力成熟策略来源于体内抗 体成熟过程。构建集中突变或特点突变的小容量抗体库，或将突变引入到原始抗体的可变区域，通常是互补决 定区，通过表面展示技术筛选出高亲和力抗体，提高抗体对靶点的结合能力，一般可得到10倍的亲和性改善。模拟体细胞高频突变：通过细胞突变和展示抗体蛋白筛选对抗原高亲和的抗体。合适的B细胞系可以作为工 具细胞，用于抗体的亲和力成熟。在具体应用中，可以将特定的抗体模板基因插到细胞的免疫球蛋白基因位 点，然后进行细胞培养和高亲和力细胞群的筛选。基于抗体库：基于抗体库的抗体亲和力成熟与基于抗体库的抗体筛选均为体外高亲和力抗体筛选，重点仍是 库的构建和筛选系统的选择。区别在于后者所用的库在构建或合成时无偏向性或只具有针对某抗原的有限的 偏向性；而前者所用的库是基于确定的抗体序列模板所构建的。突变区域的选择主要是基于抗原抗体复合物 的结构信息或胚系基因热点的预测。突变策略主要包括易错PCR、链置换、定点突变、DNA改组。,2.5生物药先导化合物的优化,抗体成药性的改善：提高热稳定性：热稳定性差可能导致抗体聚集和低表达。提高抗体的热稳定性，可通过优化疏水性核心和带电荷簇残基、可利用数据库的点突变研究和计算机的设计来优化。提高溶解度：作为临床候选药物的抗体应具有良好较佳的溶解性和黏度。提高抗体溶解度的主要方 法是去除表面疏水性。提高化学稳定性:机体内的化学降解常常会导致治疗性抗体的效力降低,抗体蛋白质结构表面上的酶 解位点也会影响抗体的化学稳定性，可应用晶体结构或计算机构建的3D模型结构来研究并改良抗体 结构表面的特性，或通过噬菌体/酵母/哺乳动物文库进行随机或靶向突变这些方法来进行改善。降低异质性:蛋白翻译后的糖基化、N-焦谷氨酰胺环化修饰引起抗体蛋白的异质性，也会引起不同生 产批次之间抗体质量的不一致。可采用“靶位点突变”去除可以引起抗体异质性的氨基酸。降低聚合性：主要方法有改变抗体框架、抗原结合环和结合域结合界面。,2.5生物药先导化合物的优化,恒定区（Fc）修饰增强效应功能和半衰期：对Fc区域的修饰可以对特定抗体的药理作用产生深远的影响，延长抗体的半衰期。Fc受体(FcR)是免疫球蛋 白G（IgG）Fc段受体,主要表达于免疫细胞膜上,在特异性抗体和效应细胞功能间象桥梁使体液免疫和细胞免疫 紧密关联。补体依赖的细胞毒性（CDC）是补体系统被激活后在靶细胞表面形成膜攻击复合体,导致靶细胞溶解 的效应。典型方法：点突变增强与FcR的结合，根据需要将突变引入抗体的Fc结构域糖基化工程改善抗体与FcR结合通过交换不同抗体亚型Fc结构域增加与FcR的结合（亚型交叉抗体）IgG多聚化以提高与FcR的结合点突变提高与血清补体(C1q)的结合以及增强补体依赖的杀伤作用插入或缺失突变引起的与C1q结合增强及补体依赖的细胞毒性(CDC)作用的增强交叉抗体亚型提高与C1q的结合IgG1六聚化形式增强与C1q结合和CDC作用,2.5生物药先导化合物的优化,双特异性抗体(BsAb)：通过基因工程手段将两个分别靶向不同抗原的抗体片段组合在一起，所以具有两种抗原结合位点，发挥协 同作用，进而提高治疗效果。这种结构设计能有效地改善抗体药物在体内的药物代谢动力学过程，增强临床治疗效果。同时识别两种分子提高了抗体的选择性和功能性亲和力，改善了药物的安全性和有效性，与 两种单克隆抗体药物联合用药治疗相比减少了开发和临床试验成本。制备方法：化学偶联法：该方法于1985年首次被使用，其原理是通过化学偶联剂将两个单抗或Fab片段偶联成一种 双特异性抗体。双杂交瘤融合法：将两种杂交瘤细胞通过细胞融合的方法，合成双杂交瘤细胞株，筛选出具有两种抗体 功能的稳定靶细胞株。基因工程法：利用基因工程技术对抗体进行改造，从而形成多种形式的双特异性抗体。,03,药物临床前生产阶段：实验研究、小量试制、中间试制,类别：化学药生产、生物药生产,基础性研究，取得制造和质量检定的基本条件和方法理化性质如分子式、结构式、解离度、PH值、熔点、沸点、冰点、渗透压工艺流程如反应条件、生产工艺、精制方法、原料规格、 结构确证、杂质研究（来源机理分析、合成分离制备、结 构确证）、晶型研究（选择依据、晶型及粒度影响因素、 晶型及粒度控制方法）。路线筛选如终产品的收率、杂质种类，结合理论选择最优研究预算如各研究阶段成本和预计周期生物药研究还包括生产用菌、毒种和细胞株的构建、培养、遗 传稳定性和生物组织选择，有效成分的提取，纯化及其理化特 性、结构与生物特征分析等研究。,3.1阶段一：实验研究,探索性开发和优化方法，对实验室原有的合成路线和方法进行全面的、系统的优化，提出一条基本适合 于中试生产的合成工艺路线。研究重点应围绕影响工业生产的关键性问题，如缩短合成路线，提高产率，简化操作，降低成本和安全生产等，确定结构、反应参数、工艺过程后处理方式、物料控制、物料属性。,根据实验研究结果：,3.1阶段二：小量试制,确定配方及给药方式,建立制备工艺和检定 方法,实验小批量样品进行 临床前初步安全性和 有效性的实验,制定制造与检定基本 要求,确定目的化合物具有 新药的可能性,验证和使用方法，把实验室研究成果扩大成中试规模的产业化生产，采用的工艺路线基本与 实验室工艺规程一致。中试规模连续生产三批产品，要求工艺稳定，质量稳定，有工艺规程和质量控制标准。三批 产品的总量要达到:自检和中检所全部检用量，加上临床前动物试验全部用量和I、I期临床试 验用量。如果临床剂量大、疗程长，需要产品量大，要根据不同产品来确定中试规模。,3.1阶段三：中间试制,工艺路线优化记 录,记录各步的体积、 浓度、纯度、回 收率等,中间产品质量控 制要求,主药与辅料相互 作用研究,依据中国药典 制剂通则的要求 进行制剂稳定性 试验研究,必须在NMPA认证 过的厂房内生产,生产工艺基本定型，产品质量和产率相对稳定，并能放大生产。,有产品质量标准、检定方法和保存稳定性资料，并有测定效价的参考品或对照品。全面、系统地完成临床前研究工作，包括药物化学研究，药理学研究(主要药效学研究、一般 药理学研究、药物代谢动力学研究），毒理学研究，以及生物等效性、生物利用度研究和耐受 性、依赖性试验等。提供自检和检定所复检报告及能满足临床试验研究用量的连续三批产品。制定较完善的制造检定试行规程和产品使用说明书(草案)。在新药临床前研究项目中，最重要 的是新药的安全性及其有效性是否优于已知药物，因此取得临床试验批件的最重要资料是满意 的药理学学和毒理学研究结果。,