冬虫夏草培植技术规程DB42／T 1272-2017.pdf

ICS 65.020.20 B 38 备案号：DB42 湖 北 省 地 方 标 准 DB 42/T 1272 2017 冬虫夏草 培植技术 规程 Technical regulations for cultivation of Cordyceps sinensis（报批稿）2017 05 16 发布 2017 09 01 实施 湖 北 省 质 量 技 术 监 督 局 发布 DB42/T 1272-2017 I 目 次 前言.III 引言.V 1 范围.1 2 规 范性 引用 文件.1 3 术 语和 定义.1 4 环 境与 设施.1 4.1 场地 环境.1 4.2 培植 厂房 设施.2 4.3 土壤.2 4.4 植物 饲料.2 4.5 水.2 4.6 土壤、饲 料和 水混 合.2 5 工 艺流 程及 技术 要求.2 5.1 培植 工艺 流程 图.2 5.2 虫种 繁育.2 5.3 菌种 培育.3 5.4 冬虫 夏草 培植.3 5.5 冬虫 夏草 采收 及采 后 处理.4 6 生 产管 理及 病虫 害防 治.4 6.1 环境 维护.4 6.2 严格 检疫.4 6.3 防止 病害 传播.4 附录A（规 范性 附录）冬虫夏 草培 植的 消毒 除菌 方法.5 A.1 培植 区域 使用 前消 毒 灭菌.5 A.2 培植 区域 日常 消毒 灭 菌.5 A.3 进入 培植 区域 器物 消 毒除菌.5 A.4 病、弱个 体灭 活处 理.5 参考文 献.6 DB42/T 1272 2017 III 前 言 本标准 按照GB/T 1.1 2009 标 准化 工作 导则 第1 部分：标准 的结 构和 编写 给出 的规 则 编 制。本标准 由湖 北省 农业 科学 院 归口。本标准 起草 单位：宜昌 山 城水都 冬 虫 夏草 有限 公司、广 东东 阳光 药业 有限 公 司、西藏 高原 雪都 冬虫夏草有 限公 司。本标准 主要 起草 人：李 文 佳、李 全平、朱 巧洪、钱 正明、贺媛、李 文庆、张 宗耀、华献 春。DB42/T 1272 2017 V 引 言 冬虫夏 草目 前在 湖北 省已 经实现 规模 化产 业培 植。经查阅，冬 虫夏 草的 培植 技术尚 无国 家标 准、行业标 准和 地方 标准。为 促进该 产业 的规 范化 生产，保 证所 生产 产品 质量 的 稳定可 靠，满 足市 场消 费 者需要，从源 头有 效缓 解冬 虫夏草 野生 资源 日益 减少 濒临灭 绝的 问题，特 制定 冬虫夏 草培 植技 术规 程。DB42/T 1272 2017 1 冬 虫夏草 培植技术 规程 1 范围 本标准 规定 了冬 虫夏 草培 植的术 语和 定义、环境 与 设施、工 艺流 程 及 技术 要 求、生产 管理 及病 虫害防治等。本标准 适用 于冬 虫夏 草的 培植。2 规范性 引用 文件 下列文 件对 于本 文件 的应 用是必 不可 少的。凡 是注 日 期的引 用文 件，仅注 日期 的 版本适 用于 本文 件。凡是不 注日 期的 引用 文件，其最 新版 本（包括 所有 的修改 单）适用 于本 文件。GB 2762 食品 安全 国家 标 准 食 品中 污染 物限 量 GB 2763 食品 安全 国家 标 准 食 品中 农药 最大 残留 限量 GB 5749 生活 饮用 水卫 生 标准 GB 50073 洁净 厂房 设计 规范 3 术语和 定义 下列术 语和 定义 适用 于本 文件。3.1 冬虫夏 草 Cordyceps sinensis 冬虫夏草 为麦 角菌科 真菌 冬虫夏草 菌Cordyceps sinensis(Berk.)Sacc.寄生 在蝙蝠蛾 科昆 虫幼虫上的子 座和 幼虫 尸体 的复 合体。待 子座 出土 约3cm 7cm，子 实体 未成 熟时 挖取，除 去似 纤维 状的 附着 物及杂质。冬 虫夏 草繁 育品 为 模拟 原生 态条 件下 抚育 而成的 冬虫 夏草。3.2 虫种 host insect species 冬虫夏 草的 虫种 蝙蝠 蛾科 昆虫属 于鳞 翅目Lepidoptera，有 喙亚 目Glossata，外 孔次亚 目Exoporia，蝙 蝠 蛾 总 科Hepialoidae。目 前 研 究 发 现 虫 草 蝠 蛾Hepialus armoricanus、小 金 蝠 蛾Hepialus xiaojincusis、比如 蝠蛾Hepialus biruensis、蒲 氏 蝠蛾Hepialus Pui、玉树 蝠 蛾Hepialus yushuensis等60 种（邱 乙等 2015）。3.3 菌种 strain 冬虫夏草 菌种 为中国 被毛 孢 Hirsutells sinensis Liu，Guo，Yu-et Zeng（1989），隶属于 子囊菌门 Ascomycota 粪 壳菌 纲 Sordariomycetes 肉 座 菌目 Hypocreales 线虫 草 科 Ophiocordycipitaceae（Sung et al.2007）。4 环境与 设施 4.1 场 地环 境 选择人 力资 源充 足，交通 便利，生态 环境 良好，水 资源丰 富，空气 和水 环境 良好的 场地。DB42/T 1272 2017 2 4.2 培植厂 房设 施 厂房须 符合GB 50073 的洁 净厂房 要求。其中100 万 级 洁净区 面积 占总 面积 的35%，10 万级 洁净 区面 积占总面 积的34%，一般 区间 占总面 积的31%。洁净 区与 周围的 空间 维持 一定 的压 差，按工 艺要 求决 定正 压与负压 差，气流 分布 均匀，高效 过滤 器的 检漏 大于99.97%，辅 助车 间采 取通 风 措施，室内 的静 压值 低于洁净区。温 度调 节范 围可-10 25，相 对空 气湿 度范围30%99%，光 照强 度范围0 lx 100 000 lx。4.3 土壤 a)土 壤要 求 土壤有 机质 含量 在3%16%，pH 5.0 8.0 之间，土 壤 粒径集 中在0.05 mm 0.25 mm之间，壤质砂 土，有少量 的石 砾，具强 度生 草腐殖 质累 积与 弱度 氧化 还原特 征。b)土 壤处 理 经过定 点取 样检 测采 集合 格的土 壤。土 壤经 流水 线 消毒后，调节 至25%55%之间的 合适 湿度，呈具一定的 凝聚 性但 不粘 黏，透气良 好的 松散 物理 结构 状态。采用 规定 的消 毒检 测流程 可将 土壤 重 复 循 环 使用。4.4 植物饲 料 a)植 物饲 料来 源 所用的 饲料 应为 冬虫 夏草 产区天 然或 种植 的蓼 科、蔷薇科、伞 形科、百合 科、毛茛 科、桔 梗科、豆科等科 属植 物的 地下 根茎 部分（张泽 锦等 2009；李 文佳等 2016）；主要 为蓼 科的珠 芽蓼、小 大黄、圆穗蓼等，一 般主 根肥 厚有 时多须 根（张泽 锦等 2009；李文 佳等 2016）。b)植 物饲 料要 求 品质新 鲜、无腐 烂、无 异 味及杂 质，有效 利用 率90%以上；重金 属含 量符 合GB 2762；农药 残留 符合GB 2763。4.5 水 冬虫夏 草的 培植 用水 需要 符合GB 5749。4.6 土壤、饲料 和水 混合 仿照青 藏高 原冬 虫夏 草产 地土壤 及天 然植 物根 茎空 间分 配 结构，铺 设培 植土 壤和饲 料植 物。土 层 厚度10 cm 30 cm。根据 具体 土 壤 质地 与植 物 饲料 根茎 质 量 密度 差别，单位 范围 内 土 壤与 饲料 重 量比 为1:0.5 1:2。5 工艺流 程及 技术 要求 5.1 培植工 艺流 程图 5.2 虫种繁 育 5.2.1 建立野 生蝙 蝠蛾 成虫 繁育 基地模拟野 生生 长环 境 植入卵 幼虫+植 入菌 僵虫 冬虫 夏草 DB42/T 1272 2017 3 在冬虫 夏草 产区 建立 成虫 繁育基 地。根 据实 际的 气 候状况，调整 基地 内土 壤 水分含 量，增 加可 食植物的物 种多 样性 与数 量。5.2.2 获得蝙 蝠蛾 卵 收集野 生蝙 蝠蛾 成虫，使 其集中 交配 产卵，收 集蝙 蝠蛾卵，在 完全 自然 的生 长状态 下，完成 卵、幼虫、蛹 阶段 的生 长发 育，蛹羽化 为成 虫，所产 大量 卵作为 冬虫 夏草 培植 的虫 源。5.3 菌种培 育 5.3.1 采集原 始菌 5、6月 份，于冬 虫夏 草产 区西藏、青 海、四川 采集 优质冬 虫夏 草。从采 集的 冬虫夏 草中 分离 菌 种，经过菌 种鉴 定，确定 为冬 虫夏草 菌Cordyceps sinensis(Berk.)Sacc.，应用 于生产。5.3.2 培养基 的组 成 加富PDA 培 养基：20%去 皮 马铃薯 煮沸30 min 后 过滤 取滤液，葡萄 糖2%3%，酵 母粉1%，蛋白 胨0.5%，磷酸二 氢钾0.1%，无 水硫 酸镁0.02%0.025%，水，pH 6.5 6.8。培养基 的所 有材 料应 符合 相应 标 准和 国家 相关 规定 的要求。5.3.3 1 级培 养 用接种 针纵 横切 割斜 面菌 种为块 状，挑取3 mm 3 mm 的菌 块按 装量250 mL 的 量 接种于500 mL容 量的1级摇瓶 中，匀浆机 捣碎，摇床培 养。通 过生 物量测 定及微 生物检 测的 结果剔 除生长 过慢及 被污 染的 摇瓶。5.3.4 2 级培 养 将1 级 培养 的菌 液 按10%20%的 量扩 至装 量 于500 mL 的1000 mL 容量 的2 级摇 瓶中，如 上培 养，设置温 度 14 20，转速 100 r/min 150 r/min，剔 除生 长过 慢及 被污 染的摇 瓶。5.3.5 38 级培 养 与5.3.4 同样 方法 扩至3 8 级摇瓶，培养，通 过生物 量测定 及微生 物检 测的结 果剔除 生长过 慢及 被污染的 摇瓶。5.3.6 发酵培 养 将 摇瓶 菌液按 体积 比 15%20%接种 量接 入发酵 罐中，再逐级 发酵 放大，进行生 物量测 定及 微生 物检测。取样 检查 是否 污染，无污 染 则 可用 于生 产。5.3.7 侵染菌 体调 配 a)菌丝 的获 得 洁净环 境下，发 酵菌 液用 离心机（1000 r/min,15 min）获 得菌 丝。b)分生 孢子 的收 集与 计数 用接种 针直 接挑 取不 同部 位的固 体发 酵菌 丝块，并 记 下重量，用 吐温80液 洗下 分 生孢子，离 心（1000 r/min,15 min）收集，再 用 血球计 数板 在显 微镜 下计 数，可计 算平均 每克 固体 培养基 所含 的冬 虫夏 草 分生孢子 量。c)高效 侵染 菌源 的配 制 按照子囊孢子50000 个/L 80000 个/L、分生孢子20000 个/L 50000 个/L、菌丝300 mg/L 600 mg/L的 比例 混合 调配 成高 效侵染 菌体。5.4 冬虫夏 草培 植 DB42/T 1272 2017 4 5.4.1 寄主幼 虫饲 育 将蝙蝠 蛾卵 按照 不同 批次 均匀投 放于 按4.6 的 规定 备 好的培 植生 态环 境中，护 理 至90%以上 寄主 幼虫发育至46 龄适 宜侵 染的 龄期。龄期 与幼 虫的 种类 以及所 用菌 种的 浓度 与侵染 力状 态相 关。5.4.2 接种 冬虫夏 草菌 对蝠 蛾幼 虫的 接种采 用针 刺、喂食、涂 抹、浸 泡及 喷雾 等方 法，根据幼 虫大 小和 菌 的 状态，采 用一 种或 几种 组合 的接种 方式。5.4.3 接种后 管理 接种后 幼虫，待 其状 态恢 复后，重新 植入 其培 植环 境中继 续发 育为 僵虫，并 长出子 座，形成 冬 虫 夏草。5.5 冬虫夏 草采 收及 采后 处理 5.5.1 冬虫夏 草的 采收 待冬虫 夏草 子座 出土3 cm 7 cm，子 实体 未成 熟时，用特 制的 冬虫 夏草 采收 工具小 心拨 开土 层，将冬虫夏 草连 同其 纤维 状附 着物一 同取 出，用 特制 的 刷子轻 柔刷 去虫 体表 面的 泥土、菌 膜和 虫卵，即获 得冬虫夏 草。5.5.2 采收检 验 剔除断 草、瘪草、腐 烂草。5.5.3 冬虫夏 草储 存运 输 保存和 运输 在低 温环 境下，温度 控制 在0 以下，密 封 包装 以防 止虫 害和 鼠害，同时 做好 防撞 措 施。6 生产管 理及 病虫 害防 治 6.1 环境维 护 定期巡 视检 查，观察 记录 环境状 况和 幼虫、僵 虫、鲜草生 长发 育状 况，维持 土壤和 空气 的温 湿 度，调整光 照，定期 进行 空间 消毒、除菌，维 持环 境洁 净度。6.2 严格检 疫 采取预 防为 主，综合 防治 的方针。每 一批 冬虫 夏草 培植前 均须 将所 使用 的厂 房区域 进行 彻底 消 毒 除菌，进 入生 产培 植厂 区的 原材料、器 具等 均需 灭菌，有害 病原 菌白 僵菌、绿 僵菌、拟青 霉菌 不 得 于 原 材料及环 境中 检出（方 法见 附录A）。6.3 防止病 害传 播 各饲育 单位 相对 隔离，禁 止不同 饲育 空间 的器 具、物品等 在未 经消 毒情 况下 交叉使 用，严 格防 范幼虫传染 病的 发生 和流 行。及时清 除发 现的 病、弱虫 及病草 等不 健康 个体，带 离饲育 区，作灭 活 处 理（方法见附 录A）。如 发现 病弱 异常个 体超 过 一 定比 例控 制限，整个 饲育 单位 灭活，清空，彻底 消毒 后，再次启用。DB42/T 1272 2017 5 附 录 A（规范 性附 录）冬虫夏 草培 植的 消毒 除菌 方法 A.1 培植 区域 使用 前消 毒 灭菌 采用二 氧化 氯消 毒机 进行 空间消 毒，二氧 化氯 浓度 为10 mg/m315 mg/m3，消毒3 h 4 h，通 风换气。检 测沉 降菌，合 格后 方可启 用洁 净区。A.2 培植 区域 日常 消毒 灭 菌 每周进 行地面、墙 壁和 工 作台的 灭菌。用75%酒精 纱 布擦洗 培养架、工 作台。部分区 域采用 紫外 照射20 min 30 min。A.3 进入 培植 区域 器物 消 毒除菌 布制品、小 件玻 璃、金属 器物，高压 蒸汽 灭菌（121，20 min）。大件机 械设 备用75%酒精 喷 雾，擦 拭表 面或 在厂 房缓 冲区紫 外消 毒，臭氧 熏蒸1 h。A.4 病、弱个 体灭 活处 理 发现的 病、弱个 体须 将其 投入专 用的 封闭 灭菌 筒中，及时 带离 培植 区域，用 专用蒸 汽灭 菌锅，湿 热灭菌法 将其 灭活，尸 体远 离厂区 深埋 处理。DB42/T 1272 2017 6 参 考 文 献 1 邱 乙，程元 柳，彭成，等 中国 冬虫 夏草 寄主 昆 虫研 究J 时珍 国医 国 药，2015，26：720 722；2 Sung GH，Hywel-jones NL，Sung JM，et al Phylogenetic classification of Cordyceps and the clavicipitaceous fugiJ Studies in Mycology，2007，57：5-59；3 张 泽锦 叶 萌 周祖 基等 冬 虫夏 草寄 主昆 虫饲养 研究 进展J 中 草 药，2009 40；8587；4 李 文佳，李 全平，魏 再鸿，等 土壤 和植 物对 冬虫夏 草寄 主昆 虫规 模化 饲养的 影响J 菌 物 学 报，2016，35：467 475。_